大豆蛋白-黃芩素的結合機制及蛋白構象和功能變化

閆馨月，賈亦佳，孫詩艷，張東蒙，耿夢潔,，楊晉杰,，Stanislav SUKHIKH,Olga BABICH，齊寶坤,3,*，李 楊,3,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.康德波羅的海聯邦大學生命系統學院，俄羅斯 加里寧格勒 236016；3.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150050）

大豆蛋白是日常膳食中優質蛋白質的重要來源，由2S、7S、11S和15S這4 類蛋白質組成，其中β-伴大豆蛋白（7S）和大豆蛋白（11S）是大豆蛋白質的2 種主要成分，分別占總質量的40%和30%[1]。7S組分由α（71 kDa）、α’（67 kDa）和β（50 kDa）亞基通過氫鍵和疏水相互作用堆積而成，11S組分由酸性亞基（37～42 kDa）和堿性亞基（17～20 kDa）通過疏水鍵和二硫鍵連接組成[2]。先前研究表明，7S組分決定大豆蛋白的乳化和起泡能力，11S組分決定大豆蛋白的凝膠性能[3]。這表明不同組分蛋白由于其功能性的差異可以在食品加工中發揮不同作用[4]。

黃芩素是從高黃芩根部提取的天然黃酮類化合物，具有抗菌、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化等功效，但由于其水溶性和穩定性較差，生物利用度低等問題，其應用始終受限。因此，國內外學者不斷運用新型的制劑手段，挖掘不同的搭載材料，以開發出有實際應用價值的黃芩素制劑[5]。

近年來，隨著對功能性復合食品體系的需求增加，蛋白質與多酚之間的相互作用越來越受到關注。據報道，蛋白質與多酚的結合既能改善蛋白質的物理化學性質[6]，同時也能提高多酚的生物可及性和生物利用度。研究證明，多酚通過非共價和（或）共價相互作用對蛋白質有很強的結合親和力[7]。Ye Jiangping等[8]發現蘆丁與大豆分離蛋白以疏水作用力結合，復合物乳液具有良好的物理穩定性。扁豆蛋白與多酚的非共價相互作用對蛋白的熱穩定性以及氧化活性有顯著提升[9]。在大豆蛋白素肉加工過程中添加不同含量的茶多酚可優化產品的色澤、質構性質和結構特性[10]。蛋白質作為多酚的穩定劑和載體，可保護它們在胃腸消化過程中免受酶促和氧化降解，并將其輸送到小腸和結腸[3]。隨著對蛋白-多酚復合物的深入研究，越來越多的酚類化合物作為生物活性物質或改性材料應用到工業食品生產中。

本研究選取7S、11S蛋白與黃芩素作為研究對象，利用多光譜技術和分子對接探究大豆蛋白-多酚的結合機制以及結構變化，進一步測定復合物的穩定性和功能特性。通過實驗和理論相結合的方法，闡明7S、11S與黃芩素的相互作用機理。本研究有助于提升大豆蛋白在工業生產中的功能性，同時可以促進黃芩素作為口服營養成分的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粉 東北農業大學大豆研究所；黃芩素上海源葉生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma-Aldrich公司；HCl、NaOH（均為分析純） 北京新光化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司；電子分析天平、F-6000熒光分光光度計 日本島津公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器股份有限公司；Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標儀 瑞士帝肯公司；TGA/SDTA851e差熱分析儀 瑞士梅特勒-托利多公司；T18basic高速乳化均質機 英國IKS公司；TM3000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 7S、11S蛋白組分以及大豆蛋白-黃芩素復合物的制備

參照Liu Chun等[11]的方法，并略作修改。脫脂豆粉溶解于去離子水，料液比為1∶15（g/mL），用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至9.0，低速攪拌1 h，4 ℃、9000×g離心30 min，收集上清液。重新溶解沉淀，調節pH值至9.0，低速攪拌1 h，相同條件下離心并混合上清液。添加0.01 mol/L NaHSO3溶液，用2 mo1/L HCl溶液調節pH值至6.4，4 ℃貯藏過夜。取溶液于4 ℃、6500×g離心20 min，水洗沉淀3 次，用去離子水溶解后調節pH值至7.5，凍干后可得11S蛋白組分。向上述上清液中加入NaCl至離子濃度為0.25 mo1/L，用2 mo1/L HCl溶液調節pH值至5.4，4 ℃、9000×g離心30 min。取上清液，加入等體積去離子水，用HC1溶液調節pH值至4.8，4 ℃、6500×g再次離心20 min。取沉淀，水洗3 次后用去離子水溶解，調節pH值至7.5，凍干后可得7S蛋白組分。

稱取一定質量黃芩素溶解于甲醇溶液中作為母液，質量濃度為10 mg/mL，置于-20 ℃保存。混合前使用Tris-HCl緩沖液將母液稀釋至質量濃度為1 mg/mL。將7S和11S蛋白組分分別溶解在Tris-HCl緩沖液中，質量濃度均為1 mg/mL。將蛋白與多酚溶液混合，室溫下低速攪拌30 min。使用3000 Da分子質量的截止膜將混合液在去離子水中透析48 h，冷凍干燥后獲得7S-黃芩素、11S-黃芩素復合粉末。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜測定

測定前取1.5 mg樣品與200 mg溴化鉀研磨混勻并壓片。波數范圍4000～400 cm-1，掃描次數64，分辨率4 cm-1，得到的紅外光譜曲線用Peak Fitting軟件擬合，分析復合物二級結構含量的變化[12]。

1.3.3 內源熒光光譜測定

參照Liu Yan 等[13]的方法，并略作修改。采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）將7S、11S樣品溶解，使其質量濃度為0.02 mg/mL。分別加入與蛋白溶液等量的不同濃度黃芩素溶液，使復合溶液中黃芩素的最終濃度為0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 μmol/L，用熒光分光光度計掃描。設定發射波長300～450 nm，激發波長275 nm，狹縫寬度5.0 nm，掃描速率2000 nm/min。

1.3.4 熒光猝滅和相互作用方式

通過Stern-Volmer方程（式（1））判斷黃芩素與7S、11S蛋白的猝滅類型[14]：

式中：F0為未添加黃芩素時的熒光強度；F為添加黃芩素時的熒光強度；[Q]為黃芩素濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數/（L/（mol·s））；τ0為未添加猝滅劑時熒光分子的平均熒光壽命，一般為10-8s。

根據靜態猝滅公式，計算表觀結合常數（Ks）（L/mol）和結合位點數（n）[14]：

通過Van’t Hoff方程（式（3）），判斷黃芩素與7S、11S蛋白的相互作用方式[14]：

式中：R為氣體常數8.314；ΔH為焓變值/（kJ/mol）；ΔS為熵變值/（J/（m o l·K））；ΔG為自由能值/（kJ/mol）；T為溫度/K。

1.3.5 分子對接分析

采用Discovery Studio 2019（DS）軟件中Libdock算法進行分子對接。從Chemicalize數據庫下載7S與11S的3D結構。將受體（7S、11S）和配體（黃芩素）的結構導入到DS軟件中，在CHARMM力場下優化其結構并調整其質子化狀態。使用DS 2019可視7S/11S-黃芩素的相互作用。

1.3.6 掃描電子顯微鏡分析

將凍干樣品粉末使用掃描電子顯微鏡在5.0 kV加速電壓下測定，放大倍數1500倍。

1.3.7 表面疏水性測定

參照He Shudong等[15]的方法，并略作修改。將20 mg樣品溶于10 mL PBS（10 mmol/L，pH 7.2）中，然后稀釋獲得0.005～2 mg/mL質量濃度的溶液，暗處反應30 min。以添加ANS的PBS作為空白對照。用熒光分光光度計測定熒光強度，激發和發射波長分別為380 nm和480 nm，縫隙為5 nm，樣品的表面疏水性表示為蛋白質濃度相對于熒光強度的線性方程式的斜率。

1.3.8 熱穩定性測定

用差示掃描量熱法測定熱穩定性[16]。將少量樣品移到鋁制坩堝中，然后將其置于氧氣流量為100 mL/min的反應爐中，保護氣體N2，氣體流速20 mL/min，溫度范圍25～125 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.3.9 乳化活性及乳化穩定性測定

參照Pearce等[17]的方法，并略作修改。采用0.01 mol/L PBS溶解7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末，使其質量濃度為1 mg/mL，取15 mL樣品溶液與5 mL大豆油混合，用高速乳化均質機均質（12000 r/min，2 min）。乳化后的樣品用質量分數0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋100 倍并混合均勻，于500 nm波長處測定吸光度，記為A0；靜置10 min后測定吸光度，記為A10；十二烷基硫酸鈉標準溶液為空白對照。按式（4）、（5）計算乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）：

式（4）、（5）中：ρ為樣品質量濃度/（g/mL）；Φ為乳化液中油相的比例，Φ＝0.25；L為比色皿的光徑；N為稀釋倍數；T為乳液靜置時間，10 min。

1.3.10 起泡性（foaming capacity，FC）和泡沫穩定性（foam stability，FS）測定

參照Sui Xiaonan等[18]的方法，并略作修改。采用0.01 mol/L PBS溶解7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末，使其質量濃度為1 mg/mL，取100 mL樣品溶液置于500 mL量筒（直徑6 cm，高度20 cm），使用高速乳化均質器處理樣品（12000 r/min，2 min）。按式（6）、（7）計算FC和FS：

式（6）、（7）中：V為初始溶液的高度/cm；V0為均質后泡沫表面的高度/cm；V10為第10分鐘泡沫表面的高度/cm。

1.3.11 抗氧化活性測定

1.3.11.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率測定

參考Sun Yufan等[19]的方法，并略作修改。稱取3.5 mg DPPH，用甲醇定容至10 mL，獲得DPPH自由基原始溶液。每次使用前將溶液稀釋，獲得DPPH自由基實驗溶液。測定時，采用蒸餾水將7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末溶解，使其質量濃度為1 mg/mL，再將該溶液用甲醇稀釋至合適濃度，與適量DPPH自由基實驗溶液混勻，避光靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度（A3）。以純溶液為樣品對照組（A2），DPPH自由基-甲醇為空白組（A1），甲醇為空白對照組（A0）分別測定吸光度。按式（8）計算DPPH自由基清除率：

1.3.11.2 2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率測定

參考Sun Yufan等[19]的方法，并略作修改。采用蒸餾水將7S、11S、7S-黃芩素及11S-黃芩素粉末溶解，使其質量濃度為1 mg/mL，取0.5 mL樣品溶液加入4 mL ABTS陽離子自由基工作液，避光靜置50 min，在734 nm波長處測定吸光度（A3）。以純溶液為樣品對照組（A2），ABTS陽離子自由基-甲醇為空白組（A1），甲醇為空白對照組（A0）分別測定吸光度。按式（9）計算ABTS陽離子自由基清除率：

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 7S、11S-黃芩素復合物的傅里葉變換紅外光譜分析

由圖1A可知，黃芩素在400～1700 cm-1處有多個特征峰。與7S、11S復合后，限制了多酚的伸縮振動，導致其特征官能團對應的吸收峰消失，表明黃芩素被成功封裝在蛋白中[20]。酰胺A帶（3200～3400 cm-1）代表N—H和O—H的伸縮振動。7S組分在此處的吸收峰強度高于11S組分，表明7S肽鏈上的氫原子更容易參與到交聯反應中，因此7S蛋白的結構更加靈活。加入黃芩素后，酰胺A帶的峰強度變化明顯，說明多酚與蛋白可以通過分子間氫鍵連接[21]。2960 cm-1處的特征峰與C—H伸縮振動有關。復合物在此處的峰強度高于單一蛋白，表示蛋白與黃芩素的結合存在疏水性作用力。酰胺I、II帶位于1500～1700 cm-1處，此處的變化與C＝O、C—N伸縮振動以及N—H彎曲振動有關。因此，多酚的添加改變了蛋白質吸收峰的強度及寬度，通過計算峰面積可知，該變化與β-折疊的減少有關（圖1B）。推測維持蛋白質構象的β-折疊在黃芩素的誘導下轉變為α-螺旋和無規卷曲。Liu Xiangju等[14]在研究不同膳食多酚對蛋白質-多酚復合物的構象變化時也發現類似結果。

圖1 7S、11S及其復合物的傅里葉變換紅外光譜（A）和二級結構（B）Fig.1 FT-IR spectra (A) and secondary structures (B) of 7S,11S and their complexes with baicalein

2.2 7S、11S-黃芩素復合物的內源熒光光譜分析

由圖2可知，11S的熒光強度高于7S，說明11S蛋白表面存在更多的發色基團參與水合作用。隨著不同濃度黃芩素的加入，7S和11S的熒光強度都逐漸降低。該現象表明黃芩素以劑量依賴性方式導致蛋白質熒光猝滅[22]。多酚的添加使蛋白質的最大發射波長向短波長方向移動。推測是由于黃芩素與蛋白質的相互作用導致芳香族氨基酸殘基周圍的微環境極性減弱，發色基團處于更疏水的環境，表明蛋白質結構變得更緊密。11S-黃芩素的熒光光譜藍移明顯，這可能與11S蛋白的結構較為疏松，更容易被多酚誘導產生構象變化有關。

圖2 不同黃芩素添加量的7S-黃芩素復合物（A）和11S-黃芩素復合物（B）熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of 7S-(A) and 11S-baicalein complexes (B)with different amounts of added baicalein

2.3 7S、11S蛋白與黃芩素結合的熒光猝滅機制

熒光猝滅根據機理可分為靜態猝滅和動態猝滅[23]。根據Stern-Volmer方程[24]，以[Q]為橫坐標，F0/F為縱坐標，可擬合出一次函數方程，通過直線斜率可求得復合物的Kq值。由圖2可知，7S、11S-黃芩素的Stern-Volmer方程線性擬合良好，表明黃芩素的猝滅方式為靜態或動態猝滅，不存在動-靜混合猝滅。由表1可知，所有樣品中，Kq的最小值為3.79×1016L/（mol·s），大于動態猝滅常數（2×1010L/（mol·s）），說明此過程為靜態猝滅。

根據靜態猝滅公式，以lg[Q]為橫坐標，lg[（F0-F）/F]為縱坐標作圖，可得一次函數方程，由此得出Ks與n值。由表1可知，溫度為310 K時，11S-黃芩素的Ks值最大（1.70×106L/mol），高Ks值表明此溫度下蛋白質與多酚之間的結合有較弱的空間位阻和較強的相互作用。7S-黃芩素的Ks值整體小于11S-黃芩素（除276 K外），推測是由于7S蛋白結構致密，活性氨基酸殘基沒有暴露，阻礙了蛋白質與多酚之間的相互作用。所有樣品的n值均大于1，表明7S/11S與黃芩素至少有一個結合位點[20]。

表1 黃芩素與7S和11S結合的猝滅常數、結合常數和熱力學參數Table 1 Quenching constants,binding constants and thermodynamic parameters for baicalein binding to 7S and 11S

2.4 7S、11S蛋白與黃芩素結合的相互作用方式

蛋白質與多酚的結合主要涉及非共價作用力。通過Van’t Hoff方程計算相應的ΔH、ΔS、ΔG，以此判斷兩者的相互作用方式[25]。選取276、298 K和310 K，測定不同溫度下的結合常數。如表1所示，7S、11S-黃芩素的ΔG絕對值較小，推測蛋白與多酚的結合僅涉及較弱的作用力。7S-黃芩素的ΔH＜0、ΔS＜0，表明7S與黃芩素的相互作用方式為氫鍵和范德華力。11S-黃芩素的ΔH＞0、ΔS＞0，說明11S與黃芩素結合時的主要作用力是疏水相互作用。原因可能是11S分子表面存在較多的疏水基團，更容易與配體的疏水區域（如苯環）結合[26]。

2.5 7S、11S蛋白與黃芩素的分子對接分析

通過分子對接可以預測黃芩素對7S和11S蛋白的精確結合位點和結合模式。由圖3可知，黃芩素A5和A7位置上的羥基氧分別與7S蛋白中Arg188（2.22 ?）和Gln365（2.36 ?）的氨基發生氫鍵相互作用。A5和A6位置的羥基作為氫供體分別與Glu367（2.75 ?）和Arg364（2.51 ?）的氧原子結合。此外，黃芩素的苯環（A環和C環）也可以與7S蛋白的Arg329（4.74 ?）和Ile330（5.36 ?）構成疏水相互作用。由于7S-黃芩素的疏水相互作用較弱且數量較少，因此兩者的結合主要依靠氫鍵。不同于7S蛋白的親水性，11S表面擁有大量的疏水性氨基酸。因此，11S蛋白與多酚的結合通常依賴于疏水性作用力。包括A環與Val162（5.26 ?），B環與Met177（5.24 ?）和Arg161（5.41 ?）以及C環與Arg161（5.28 ?）和Ile171（5.18 ?）。此外，C4位置的羰基氧能與His173以氫鍵結合。結合和對接分數可以進一步反映7S、11S蛋白與黃芩素的結合親和力。結合能絕對值或對接分數越高證明親和力越強[27]。由表1、2可知，結合能的理論值與熒光猝滅的分析結果存在一定差異，但變化趨勢一致。

圖3 黃芩素與7S（A）和11S（B）的結合模式Fig.3 Binding patterns of baicalein with 7S (A) and 11S (B)

表2 黃芩素與7S和11S結合的能量及評分Table 2 Energy and score of baicalein binding to 7S and 11S

2.6 7S、11S蛋白與黃芩素復合物的掃描電子顯微鏡分析

由圖4可知，7S蛋白具有片狀及球形結構，11S蛋白既有片層狀結構也有較大的塊狀結構。這與不同蛋白的亞基數量及結構柔性有關，11S蛋白結構呈剛性，導致其溶解性較差。因此，11S蛋白的微觀結構圖中出現較多塊狀聚集體。加入黃芩素后，7S蛋白的聚集性增強。此外，由于復合物分子間的非共價相互作用導致未折疊和柔性蛋白質經歷部分重折疊過程，形成更多的球形結構。11S蛋白的結構柔性較弱，添加黃芩素后并未出現明顯的構象變化，但同樣會使部分原始結構轉變為球形或桿狀結構。

圖4 7S、11S及其復合物的微觀結構Fig.4 Microstructure of 7S,11S and their complexes with baicalein

2.7 7S、11S蛋白與黃芩素復合物的表面疏水性分析

由表3可知，與7S相比，11S的表面疏水性較大。有研究表明，中性pH值條件下11S蛋白酸性亞基呈親水性，堿性亞基呈疏水性；7S蛋白的α和α’亞基呈親水性，β亞基呈疏水性。但7S蛋白分子中含有N-糖鏈，因此整體親水性高于11S蛋白[5]。加入黃芩素后，7S和11S的表面疏水性都降低。原因有兩點：1）添加黃芩素引入了親水性羧基，導致復合物整體的疏水性下降；2）黃芩素誘導蛋白的構象變化，芳香族基團被掩埋，使疏水性亞基數量減少。Ren Cong等[28]研究花青素與蛋白的結合作用時也有類似的結果。

表3 7S、11S及其與黃芩素復合物的功能特性Table 3 Functional properties of 7S,11S and their complexes with baicalein

2.8 7S、11S蛋白與黃芩素復合物的熱穩定性分析

由表3可知，7S、11S蛋白的變性溫度（Td）分別為77.76 ℃和75.00 ℃，變性焓（ΔH）分別為-52.79 J/g和-63.08 J/g，溫度與焓值的差異歸因于蛋白的亞基數量和構象靈活性。7S蛋白主要由α、α’和β亞基組成，結構柔性大；11S蛋白由6 個酸性亞基和5 個堿性亞基組成，結構剛性大[5]。因此，11S蛋白的變性需要更多能量。添加多酚后，蛋白的Td降低而ΔH的絕對值提高，原因可能是蛋白質分子內二硫鍵與巰基相互交換，導致空間結構改變，從而增加變性難度[28]。

2.9 7S、11S蛋白與黃芩素復合物的乳化活性及乳化穩定性

如表3所示，7S與11S的EAI值分別為10.52 m2/g和7.25 m2/g。研究表明，EAI與蛋白質空間構象的靈活性密切相關[29]。由于11S蛋白的分子內二硫鍵較多，亞基締合結構致密，相比于7S蛋白，不僅分子質量大而且具有更加剛性的空間構象。結構的靈活性較差導致11S蛋白分子移動至油水界面的速度緩慢，因此其EAI值較低。黃芩素的添加提高了蛋白的乳化活性，推測是由于多酚與蛋白質相互作用，導致蛋白的構象更加靈活。柔性結構加快了乳液中蛋白分子在油水界面的重排速度，因此EAI值增大。

乳化穩定性是指油-水界面聚集并穩定小液滴的能力[30]。由表3可知，11S蛋白的乳化穩定性優于7S蛋白。推測該現象與11S蛋白的表面疏水性有關。由于11S蛋白分子更易聚集，其不溶性聚集體能夠在油水界面形成網絡結構，抑制油滴的聚攏。因此，11S蛋白擁有較高的ESI值。Tang Chuanhe[31]構建了7S與11S蛋白于油水界面處的吸附行為模型，也得出了類似結論。加入多酚使蛋白質的ESI值提高，歸因于復合物具有較強的分子間和分子內作用力，形成了更加剛性且有序的界面膜。因此，復合物乳液比純蛋白乳液具有更高的乳化穩定性。

2.10 7S、11S蛋白與黃芩素復合物的FC及FS

蛋白的FC是指蛋白溶液在攪打過程中產生泡沫的能力，受電荷密度、分子大小以及疏水性等因素影響[32]。由表3可知，7S蛋白的FC值較高，歸因于7S蛋白分子在空氣-水界面處的張力較小、界面儲存模量較大。加入黃芩素后，蛋白的FC值提高。推測是由于復合物結構的柔性增強，更容易被吸附到空氣-水界面上，降低了界面的表面張力[33]。FS是指蛋白具有足夠的黏度以維持結構并防止破裂和聚結的能力[32]。觀察到FS值的變化趨勢與FC值相同。表明7S蛋白在空氣-水界面處更易形成具有較大黏性和彈性的薄膜。加入多酚后，蛋白的FS值增大。原因可能是界面吸附的蛋白含量增加，導致泡沫表面膜黏性提高，有效降低液體析出，更有利于泡沫的穩定。

2.11 7S、11S蛋白與黃芩素復合物抗氧化活性

由表3可知，7S蛋白的DPPH自由基清除能力高于11S蛋白，這與蛋白分子表面的電荷數量密切相關。先前的研究表明7S的等電點為4.8，而11S的等電點為6.4[5]。推測在中性環境下，7S蛋白攜帶大量電荷，有利于為DPPH自由基提供更多電子。因此，其DPPH自由基清除能力更強。有研究證明，B環上有游離鄰苯二酚基團的多酚類物質（如黃芩素、槲皮素等）的抗氧化能力較強[9]。因此，蛋白-多酚復合物的DPPH自由基清除率都顯著增強（P＜0.05）。11S-黃芩素的抗氧化能力提升更明顯，原因可能是11S蛋白與黃芩素之間主要是疏水性作用力，并未消耗多酚A、B環上的活性羥基，11S-黃芩素復合物可以提供更多的氫離子用來形成DPPH—H化合物。

ABTS陽離子自由基的變化趨勢與DPPH自由基相似。有研究指出抗氧化能力包括斷鏈和供氫兩種能力[34]。本實驗結果表明添加多酚對這兩種能力均有一定影響，紅外光譜的研究結果可以驗證這一結論。

3 結論

采用多光譜技術和熱力學方法相結合，研究7S、11S-黃芩素的結合機制。結果表明，黃芩素與7S或11S結合的主要驅動力分別是氫鍵或疏水相互作用。與7S相比，11S對黃芩素的結合能力更強，結合位點更多。黃芩素與7S、11S復合后，蛋白組分的部分由β-折疊轉化為α-螺旋和無規卷曲，活性基團的微環境極性增強。此外，黃芩素的添加使蛋白組分的表面疏水性下降，熱穩定性提高，乳化性、FC以及抗氧化活性均有所改善。本研究比較了7S、11S與黃芩素之間的相互作用機制，闡明了復合物的結構與特性變化，為黃芩素在功能性食品中的應用提供了有價值的證據，進一步強化7S、11S在食品工業的應用潛力。