米糠多糖-乳清分離蛋白美拉德反應及其產物表征

吳 爽，王 涵，王 展,2，沈汪洋,2，胡中澤,2，周 堅,2，黃文晶,2,*

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430048；2.大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430048）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）是一種優質蛋白，含多種必需氨基酸與生物活性成分[1]，其分子中含有的兩親性基團，賦予了其極佳的表面活性，從而使其制備的納米乳液具備包載疏水性物質的特性。研究表明WPI在高溫、高鹽和酸等加工方式的影響下易變性或聚集，進而導致產品的品質不穩定，這些因素極大限制了WPI在食品納米工程中的應用。為拓寬WPI的應用領域，對WPI修飾改性被廣泛研究。近年來，以美拉德反應為機理的蛋白質-糖接枝改性方法得到了研究人員的廣泛關注[2-4]，改性后的蛋白功能特性得到了極大的改善[5-6]，Wang Luhui等[7]發現鴨蛋清蛋白-麥芽糊精復合物乳化性更穩定，能承受離子濃度和酸性條件變化對乳化性的影響。Yi Jiang等[8]用β-乳球蛋白-葡聚糖復合物包載β-胡蘿卜素，顯著提高β-胡蘿卜素在胃環境中的穩定性（P＜0.05）。報道表明定向的美拉德反應可有效改善蛋白的乳化活性和乳化穩定性，此方法操作簡單、綠色健康，在食品的加工中被廣泛應用[9]。

我國是全球水稻生產量和消費量最大的國家[10-11]，而米糠作為主要加工副產物，主要部分被應用于飼料加工行業，應用附加值相對較低[12-13]。米糠多糖（rice bran polysaccharide，RBP）是米糠的主要成分之一，是天然可再生資源，具有無毒、生物相容性高和可生物降解等獨特優點[14]。研究表明RBP能夠提高人體免疫力，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂和降血糖等多種生理功能[15-19]，在保健品、乳制品、面包等食品工業領域都有廣泛應用。天然多糖分子鏈上含有大量的羥基和醛基等活性位點，非常有利于修飾，能可控改變其物理化學性質，賦予多糖新的特性，如增加多糖的親水性或疏水性，改變多糖的分子質量、凝膠性、流變學性和成膜性等，便于拓寬多糖的應用領域，特別是在多糖載體的研究和開發應用等方面。多糖修飾常用的方法有物理法、生物法和化學法[20]。物理法一般通過擠壓、超聲波、微波等方式改變RBP的糖苷鍵[20-24]；生物法一般采用生物發酵法和酶法修飾RBP的主鏈或側鏈[25]；化學法用化學反應方式對RBP的結構進行修飾，最常用的是硫酸化[26-27]。RBP的大分子鏈上也存在眾多活潑基團如羥基、羧基或醛基等易被修飾改性，可以與蛋白和多肽等大分子發生美拉德反應，形成共價化合物，相比其他化學修飾方法，美拉德反應修飾多糖更符合食品工業“綠色安全標簽”需求；且多糖對胃液中的胃蛋白酶的水解能力具有較高的抵抗性，可展現良好的消化穩定性[28-29]，具有提升WPI消化穩定性的潛力。與其他單糖和多糖相比，RBP屬于雜聚糖，其分子質量較大，與WPI改性結合后吸附在油滴表面的吸附層也會更厚，因此具有乳化性能更強的潛力[30]。Delahaije等[31]研究了單糖（木糖、葡萄糖）、麥芽三糖和麥芽五糖對糖基化馬鈴薯蛋白制備乳液穩定性的影響，結果表明，與單糖相比，麥芽三糖和麥芽五糖顯著增加了乳液的穩定性，該研究說明多糖修飾的蛋白相比單糖修飾的蛋白乳化性更好。因此本研究選擇RBP修飾WPI，期望發揮兩者的協同作用，優化WPI的乳化性、耐熱性、耐酸性等功能特性[32-33]，同時發揮RBP的多種生理功能，不僅可得到高效穩定的口服新型乳化劑，還可開拓RBP的應用領域，對推動我國水稻產業綠色高值發展具有重要意義。

因此，本實驗采用干熱法制備WPI和RBP的美拉德反應產物，以A294nm、褐變程度、色澤變化、游離氨基含量等變化監測美拉德反應進程，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定產物的分子質量，對美拉德反應產物的粒徑、乳化性和微觀結構等進行表征，旨在為RBP用于WPI的美拉德反應改性提供理論基礎，拓展RBP應用領域、滿足人們對營養健康食品的消費需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（純度90%） 美國Hilmar 公司；RBP（純度96%，分子質量5～450 kDa） 陜西金潤生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA） 南京都萊生物技術有限公司；考馬斯亮藍R-250 柯意哲（上海）機電工程有限公司；蛋白質Marker（分子質量10～180 kDa） 碧云天試劑公司；金龍魚大豆油（食品級） 益海嘉里有限公司；其他所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-18真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；ST3100 pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；101型電熱鼓風干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；S-3000掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立儀器公司；CS-10型色差儀 杭州彩譜科技有限公司；ZEN3600激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-RBP糖基化產物的制備

將WPI與RBP按照1∶1（m/m）比例溶于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）中，保證固形物質量分數為6%，調節溶液pH 8.0，在恒溫磁力攪拌器中連續攪拌5 h，將其充分混合后冷凍干燥，凍干后的粉狀物過100 目篩后放置于干燥器中（容器底部放置飽和KBr溶液），將干燥器置于鼓風干燥箱中并調節溫度60 ℃從而保持干燥器內相對濕度為79%，反應6、12、18 h后即得WPI-RBP接枝物，所得產物置于-20 ℃冰箱中儲存。

1.3.2A294nm和褐變程度的測定

用超純水稀釋蛋白樣品至2.5 mg/mL，以超純水作空白樣，采用紫外-可見分光光度計測定A420nm，即產物的褐變程度；而美拉德反應的中間產物常用294 nm波長處吸光度表示，將待測樣品稀釋到1 mg/mL，測定A294nm。

1.3.3 色差分析

參考夏明敬等[34]的方法并稍作修改。稱取適量樣品于透明密封袋中，色差儀校準黑白背景板后，測量蛋白的L*、a*和b*值。每個密封袋上取3 個點測定，以WPI為參考對照。根據下式計算樣品總顏色變化ΔE：

式中：ΔE為色差；L*為亮度值（0～100為表示由黑到白）；a*為紅色（＋）或者綠色（-）；b*為黃色（＋）或者藍色（-）。

1.3.4 游離氨基含量的測定

參考Mu Lixia等[35]的方法并稍作修改。稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醛中，分別加入200 g/L的SDS溶液2.5 mL、0.1 mol/L的四硼酸鈉溶液25 mL、100 μLβ-巰基乙醇，添加超純水定容至50 mL，配制OPA試劑。測定時，用移液槍取OPA試劑4 mL于離心管中，分別注入200 μL待測液，渦旋30 s混勻后于35 ℃的水浴鍋中反應2 min，使用紫外分光光度計在340 nm波長處測其吸光度，以加入200 μL水的OPA試劑為空白樣，兩者之差ΔA為自由氨基的凈吸光度。以賴氨酸作出標準曲線，根據ΔA計算樣品中自由氨基的含量，以未經改性的乳清蛋白為標準，計算各樣品中游離氨基含量的相對百分比。

1.3.5 SDS-PAGE分析

參考Qin Xingang等[36]的方法并稍作修改。配制12%的分離膠和4%的濃縮膠。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）溶解蛋白樣品，使其保持相同的蛋白濃度，然后在低速離心機中以5000 r/min離心5 min，取上清液40 μL，加入10 μL的5×上樣緩沖液，然后在沸水浴中加熱5 min后上樣。電泳過程中保持恒壓，濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓調至120 V。電泳結束后將凝膠取出，用考馬斯亮藍染色30 min，使用脫色液脫色至透明，用凝膠成像系統進行成像處理。

1.3.6 乳化性能測定

參考朱巧梅等[37]的方法并稍作修改。乳狀液的乳化性質用乳化活性指數（emulsification activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsification stability index，ESI）表示。取0.1 g樣品蛋白溶于10 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，加入4 mL的大豆油，在10000 r/min高速分散3 min后，分別于第0分鐘和第10分鐘從溶液底部吸取50 μL乳濁液，加到5 mL、0.1% SDS溶液中，于500 nm波長處測定吸光度，以0.1% SDS溶液為空白。EAI和ESI計算公式如下：

式中：A0為乳狀液第0分鐘500 nm波長處的吸光度；A10為將乳狀液靜置10 min后所測得的吸光度；10為兩次測定乳化穩定性時間間隔（min）；DF為稀釋倍數；C為蛋白質量濃度/（g/mL）；θ為油相占體積分數；Φ為比色皿光程。

1.3.7 SEM分析

用導電雙面膠將樣品固定在樣品臺上，取適量樣品撒在雙面膠上，用洗耳球吹去多余的粉末，真空噴金后置于SEM中觀察并拍攝樣品形貌照片。

1.3.8 粒徑分析

將不同反應時間的樣品溶于超純水中，配制成1 mg/mL，使用ZEN3600粒度儀測量粒徑分布。

1.3.9 納米乳液穩定性分析

1.3.9.1 納米乳液的制備

取一定質量的蛋白溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）室溫下攪拌使蛋白溶解，以一定的比例加入大豆油，在10000 r/min高速剪切5 min，在通過單因素試驗高壓均質得到納米乳液。

1.3.9.2 納米乳液制備高壓均質單因素試驗

以納米乳液粒徑和聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）為評價指標，探究均質壓力、均質循環次數、乳化劑質量分數、油相體積分數對納米乳液的影響。

1）改變均質壓力為4000、7000、10000、13000、16000 psi，固定均質循環6 次、WPI質量濃度1 g/100 mL、大豆油體積分數4%；2）改變均質循環次數為2、4、6、8、10 次，固定均質壓力16000 psi、WPI質量濃度1 g/100 mL、大豆油體積分數4%；3）改變WPI質量濃度為1、3、5、7、9 g/100 mL，固定均質壓力16000 psi、均質循環6 次、大豆油體積分數4%；4）改變大豆油體積分數為2%、6%、10%、14%、18%，固定均質壓力16000 psi、均質循環6 次、WPI質量濃度5 g/100 mL。

1.3.9.3 pH值、鹽離子濃度對乳液穩定性的影響

用1.3.9.2節得出的單因素條件制備原始蛋白和改性蛋白穩定的納米乳液，考察不同pH值、鹽離子濃度對乳液粒徑的變化。

pH值對乳液穩定性的影響：用NaOH和HCl溶液將乳液調至不同pH值梯度（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）后，測定乳液粒徑及其PDI。

鹽離子濃度對乳液穩定性的影響：分別配制一定濃度的WPI以及糖基化WPI溶液，向其中添加NaCl，使溶液中NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，分別測量不同NaCl濃度下的乳液粒徑及其PDI。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 A294nm和褐變程度的分析

美拉德反應中間階段常用294 nm波長處吸光度表示，而A420nm是最終產物的評價指標之一，WPI與RBP的接枝反應會發生顏色的褐變，其褐變與美拉德反應進行的程度呈正相關[38]。如圖1所示，隨著美拉德反應時間的延長，WPI-RBP接枝物在294 nm和420 nm波長處的吸光度均顯著上升（P＜0.05），說明體系發生了美拉德反應，在干熱處理過程中，WPI的結構部分展開，蛋白質的ε-氨基與RBP的羰基受熱結合在一起，生成了中間產物；同時，部分中間產物發生凝聚聚合生成類黑素，使蛋白的褐變程度上升[39]。

圖1 WPI及WPI-RBP接枝物反應體系A294nm及A420nm變化Fig.1 Changes in the absorbance of MRPs at 294 and 420 nm with reaction time

2.2 色澤變化

WPI和RBP美拉德反應產物隨反應時間的延長顏色變化如圖2所示，隨著美拉德反應時間的延長，WPIL*值由87.75逐漸減小，反應18 h后降低到63.46；WPIa*值顯著提高（P＜0.05），由原始的2.97逐漸變大到10.63；b*值由原始的16.09逐漸增加到25.20；ΔE值也顯著提高到45.65，說明顏色逐漸變暗，紅色與黃色逐漸加深，與原始蛋白的色差隨反應時間的延長越來越大，這表明美拉德反應時間越長，WPI與RBP間的糖基化程度越高，顏色變化越明顯。與此結果類似的是，王晨瑩[40]研究表明蛋清蛋白與低聚異麥芽糖的反應隨美拉德反應時間的延長，與原始蛋清蛋白的色差越大。

圖2 WPI及WPI-RBP接枝物反應體系色差分析Fig.2 Change in the color difference of MRPs with reaction time

2.3 游離氨基含量的測定結果

如圖3所示，蛋白質的游離氨基含量呈先減小后增大的趨勢，這與王麒等[41]的研究相符。由于美拉德反應初期，WPI結構部分展開，WPI與RBP受熱后逐步結合，游離氨基含量下降，但進一步加熱時，WPI中的部分賴氨酸會被破壞，另外加熱也會使WPI蛋白結構充分延展，蛋白分子之間的相互作用增強，導致蛋白質凝聚，接枝概率下降，不利于WPI和RBP之間接技反應的進行，最終反而導致接枝度降低，游離氨基含量升高。陳又銘等[42]研究發現玉米醇溶蛋白與菊粉的干熱反應中，隨美拉德反應的時間延長，接枝度先增后減。美拉德反應中接枝度的增加代表著游離氨基含量的減少，楊旭等[43]對茶渣蛋白的糖基化改性也得出同樣的結論。

圖3 WPI及WPI-RBP接枝物游離氨基含量Fig.3 Change in the free amino acid content of MRPs with reaction time

2.4 SDS-PAGE結果

由圖4 可知，泳道2 中乳清蛋白的分子質量為15 kDa，反應6、12、18 h的蛋白分子質量分別為17.3、17.0、16.9 kDa，與原WPI相比平均增加2.1 kDa，這是因為RBP的糖鏈接枝到WPI上，增加了WPI的分子質量。同時可以看到美拉德反應后的蛋白樣品條帶顏色變淡，這也是蛋白發生美拉德反應后的一個顯著特征，這進一步驗證，經干熱處理，WPI與RBP確實發生了以共價鍵形式結合為基礎的接枝反應，生成了分子質量較大的物質。

圖4 WPI及WPI-RBP接枝物SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE profiles of WPI before and after glycation

2.5 乳化性能測定結果

如圖5所示，隨干熱時間的延長，WPI-RBP共聚物的乳化性顯著增強（P＜0.05），加熱處理18 h的WPI-RBP糖基化產物EAI由初始值87.86 m2/g增加至422.29 m2/g；與原WPI相比WPI-RBP接枝物ESI值增加了86%，這均表明，糖基化反應顯著改善了WPI的乳化活性和乳化穩定性（P＜0.05），可能的原因有兩個：一方面RBP接枝到蛋白上后，帶來的空間位阻效應能使得接枝物更加緊密地吸附在油-水界面上，形成致密的界面膜，從而提高WPI的乳化活性；另一方面加熱使WPI的疏水基團暴露，提高了其乳化性[44]。孫煒煒[45]用葡聚糖（分子質量分別為67、150 kDa）對WPI糖基化改性，與WPI相比，WPI-G67和WPI-G150的EAI分別提高43.2%和52.7%，ESI分別提高18.96%和27.52%，且WPI-G150的EAI和ESI都比WPI-G67大。這是因為多糖的分子質量越大，與WPI改性結合后吸附在油滴的吸附層更厚，因此具有更佳的乳化性能[30-31]，此外，多糖的分子質量大，也能夠提供更大的空間位阻阻止油滴聚集，提高WPI乳化性[46]。而RBP是大分子多糖，與WPI美拉德反應改性后的蛋白與其他單糖和多糖相比具有更好的乳化性。Li Yue等[47]也得出同樣的結論，其研究的葡萄糖和葡聚糖對糖基化大米蛋白乳化特性的影響，結果表明葡聚糖的乳化性能顯著高于葡萄糖（P＜0.05）。

圖5 WPI及WPI-RBP接枝物的EAI（A）和ESI（B）Fig.5 EAI (A) and ESI (B) of WPI and WPI-RBP conjugates with different reaction times

2.6 SEM分析

由圖6可知，WPI的表面結構與其接枝物明顯不同，WPI是典型的球蛋白，其呈現球狀結構且表面較為光滑；而接枝物以混亂的聚集團狀結構形式出現，這可能是由于WPI與RBP糖分子共價結合后，WPI的二級結構遭到破壞，分子充分伸展開來，RBP糖分子結合在蛋白分子表面，導致WPI蛋白分子球狀結構的喪失。

圖6 WPI及WPI-RBP接枝物SEM圖譜Fig.6 SEM images of WPI and WPI-RBP conjugates with different reaction times

2.7 粒徑分析

從圖7可以看出，WPI@（WPI制備的納米乳液）及WPI-RBP@（WPI-RBP改性制備的納米乳液）的粒徑大小依次為WPI-RBP（6 h）@＜WPI-RBP（12 h）@＜WPI@＜WPI-RBP（18 h）@，蛋白在糖基化反應18 h后粒徑顯著增加，隨著美拉德干熱反應的進行，蛋白的熱聚集程度增大，WPI蛋白聚集產生粒徑較大的顆粒，這進一步驗證了2.6節的結論，且WPI@和WPI-RBP（18 h）@還呈現一些小峰，粒徑分布不均勻，這是因為隨著美拉德反應的進行，WPI的溶解度上升，對水的吸附能力增強，因此粒徑變小；但隨著反應時間的延長，WPI分子的疏水基團暴露，溶解度下降，粒徑變大。

圖7 WPI@及WPI-RBP@接枝物粒徑分布Fig.7 Particle size distribution of WPI@ and WPI-RBP@ conjugates

2.8 納米乳液穩定性分析

從圖8可知，隨均質次數的增加，粒徑和PDI呈先減小后增大的趨勢，均質6 次測得的粒徑和PDI較小，這是因為在均質過程中隨著均質次數的增加，乳液的粒徑會更小，粒徑分布更均勻，乳液分散的更穩定，但隨著均質次數的繼續增加，粒徑又會有增加的趨勢，乳液變得不穩定，可能是因為均質次數增加，導致乳液溫度升高，打破了已形成的乳液體系，乳液失穩；隨壓力的增加，粒徑和PDI呈下降的趨勢，在壓力為16000 psi時，乳液粒徑和PDI最小，考慮到均質機在壓力過大時由于自我保護會暫停，且壓力過大時，溫度會隨之升高，會造成油脂的氧化，因此選擇均質壓力為16000 psi；隨WPI質量濃度的增加，乳液粒徑和PDI呈現先下降后上升的趨勢，在WPI質量濃度為5 g/100 mL時粒徑和PDI最小，WPI質量濃度低時，蛋白不足以完全包裹住油滴，使油滴聚集，粒徑增大，當WPI質量濃度高時，又會使蛋白質之間會發生聚集，使粒徑增大；隨油相含量增加，粒徑和PDI呈上升趨勢，此時蛋白質不足以完全包裹大豆油，使大豆油聚集，粒徑增大。由此得出制備納米乳液的條件為均質6 次、均質壓力16000 psi、WPI質量濃度5 g/100 mL、大豆油體積分數6%。該條件制備的納米乳液符合實驗需求，可用于后續實驗。

圖8 均質次數（A）、壓力（B）、WPI質量濃度（C）和大豆油體積分數（D）對納米乳液粒徑和PDI的影響Fig.8 Effects of number of homogenization cycles (A),pressure (B),WPI concentration (C) and oil phase concentration (D) on particle size and PDI of nanoemulsion

如圖9A所示，納米乳液WPI-RBP（12 h）@在不同pH值存在條件下粒徑小于納米乳液WPI@，說明納米乳液WPI-RBP（12 h）@的pH值穩定性顯著優于納米乳液WPI@，WPI@在pH 5時的粒徑為700 nm左右，PDI達到0.367，乳液接近失衡，而WPI-RBP（12 h）@粒徑恒定維持在200 nm左右，展現了其耐酸的功能特性，這是因為WPI的等電點在5左右，蛋白質在等電點附近時的表面凈電荷為0，WPI因失去靜電斥力作用，分子間作用力減弱，蛋白質會絮凝、沉淀，而改性WPI-RBP在等電點處的靜電斥力增強，蛋白分散較為均勻，提升了納米乳液的耐酸穩定性。納米乳液WPI-RBP（12 h）@在pH 4時粒徑上升至335 nm，這是因為美拉德反應后WPI等電點偏移到4左右，但PDI僅為0.251，說明納米乳液均一性較好，且其粒徑和PDI仍顯著低于WPI@的粒徑和PDI，表明改性后的WPI共價接入RBP糖鏈后，親水性提高，阻止了蛋白的聚集，提升了納米乳液耐酸功能特性。

納米乳液的穩定性的影響因素除了pH值外，鹽離子濃度也是重要因素之一[48]。如圖9B所示，鹽離子濃度對納米乳液粒徑的影響與未改性的納米乳液WPI@相比，納米乳液WPI-RBP（12 h）@相對穩定，PDI在0.2左右，說明其粒徑分散均勻；在NaCl濃度為0.5 mol/L時，WPI@粒徑相比WPI-RBP（12 h）@增加了19%，PDI接近0.3，WPI在鹽離子存在下由于鹽析作用會發生沉淀，而WPIRBP糖基化改性后蛋白質在一定程度上能夠抵抗鹽離子對體系的影響，提高了乳液的鹽離子穩定性。

圖9 pH值（A）和鹽離子濃度（B）對納米乳液粒徑的影響Fig.9 Effects of pH (A) and salt ion concentration (B) on particle size of nanoemulsion

上述結論表明，本研究對WPI采用美拉德反應方式改性，顯著提升了WPI-RBP@納米乳液的耐酸耐鹽功能特性，可進一步提升該納米乳液體內消化穩定性，有助于遞送脂溶性營養素的口服吸收研究，拓展該納米乳液應用領域。

3 結論

通過干熱法調控WPI與RBP發生美拉德反應，實現對WPI修飾改性，探究反應時間對其產物結構和功能特性的影響。通過分析A294nm和褐變程度、色澤變化及游離氨基含量的變化，調控混合體系發生美拉德反應的程度；采用SDS-PAGE分析WPI美拉德反應產物分子質量的變化，接枝后蛋白分子質量比WPI分子質量增加2.1 kDa；美拉德反應時間12 h后的產物顯著提高了WPI的乳化活性和乳化穩定性，其制備納米乳液粒徑相對較小且分布均勻；納米乳液WPI-RBP（12 h）@比納米乳液WPI@粒徑小且穩定，能抵抗酸性條件下和鹽離子存在條件下對乳液的不利影響，有助于遞送脂溶性營養素的口服吸收。因此，WPI和RBP之間的美拉德反應為改善WPI功能性開辟了一條新的途徑，糖基化WPI-RBP產物可作為一種新型的乳化劑用于包載疏水性物質，同時可加強對米糠資源的綜合利用研究，提高米糠的利用率，對深入研究和開發米糠資源意義重大。