剁椒姜絲后熟階段微生物與揮發性風味物質的相關性

田葉新，母應春,*，蘇 偉,2，尹學東

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省農畜產品儲藏加工技術重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴三紅食品有限公司，貴州 遵義 563099）

中國的辣椒產量居世界首位，辣椒中含有能夠促進人體健康的化合物，如辣椒素、類胡蘿卜素等[1]。剁椒姜絲（DJJS）是以辣椒和姜絲為主要原料發酵制作而成。剁椒酸辣適宜、風味醇厚，深受大眾喜愛[2-3]。生姜中含有多種功能性成分，如姜辣素、姜烯酚和姜酮等酚類成分，嘌呤類化合物以及姜油等揮發油類[4-5]，其中生姜黃酮可有效抑菌[6]并且能增加產品風味。

在蔬菜的自然發酵過程中，附著在蔬菜表面的微生物在低氧環境中生長成為發酵過程中的優勢微生物[7]，但此過程不可避免的會存在雜菌。將DJJS進行巴氏殺菌后裝罐密封發酵，經過一段時間的貯藏達到生理上的完全成熟，此過程為后熟階段，可有效抑制雜菌繁殖。后熟階段的發酵制品的刺激性氣味消失，取而代之的是香氣濃厚、口感清爽且風味獨特的產品。

目前，具有獨特風味和營養的發酵制品正成為熱點，但對DJJS后熟階段微生物與揮發性風味物質的相關性研究仍是空白。如今，高通量測序技術已用于各發酵食品中微生物群落的監測[8]，因效率高、準確率高等特點被應用于微生物多樣性的研究[9-11]，且常結合代謝組學以研究食品揮發性風味。楊帆等[9]采用高通量測序方法分析了不同豆瓣醬商品及農家自制豆瓣醬發酵各階段樣品的微生物多樣性。Wang Jingjing等[12]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術分析了剁椒自發發酵過程中揮發性化合物的含量。因此，通過結合代謝組學技術可全面分析傳統發酵食品中微生物與風味的關系。

本研究以后熟階段的DJJS為研究對象，利用高通量測序和HS-SPME-GC-MS分析后熟過程中微生物群落結構、揮發性風味物質及理化特性的變化，并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等方法研究DJJS后熟過程中微生物群落和揮發性風味物質的相關性，旨在為DJJS的品質研究提供更有力的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用DJJS由貴州省貴三紅食品有限公司生產，產品經巴氏殺菌后貯藏在37 ℃條件下加速后熟。隨機選取同一批次的產品進行實驗。在后熟階段的第0、3、7、14天，分別隨機取樣3 罐混合均勻。無菌條件下取樣10 g，用于DNA提取和高通量測序，剩余樣品裝入無菌袋于-80 ℃條件下貯存[13]，以供后續測定理化指標和風味成分。

氫氧化鈉 重慶川東化工（集團）有限公司；酚酞、亞鐵氰化鉀 四川省成都金山化學試劑有限公司；乙醇、酒石酸鉀鈉 上海麥克林生化科技股份有限公司；硫酸銅 廣東光華科技股份有限公司；乙酸鋅 天津市科密歐化學試劑有限公司；動力土壤DNA分離試劑盒美國Omega BioTek公司。

1.2 儀器與設備

GeneAmp 9700 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計、Trace1300-TSQ8000 GC-MS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Illumina HiSeq 2500 測序儀 美國Illumina公司；FA1004N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；SoilStik pH計 美國Spectrum公司；SX型馬弗爐 江蘇省無錫市華瑞普邦科技有限公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭 美國安捷倫公司；Protable refractometer手持糖度計 上海淋譽貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標測定

參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[14]、GB 12456—2021《食品中總酸的測定》[15]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》[16]和GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[17]的方法對樣品水分、總酸、灰分和還原糖含量進行測定；使用pH計和手持糖度計直接測定DJJS的pH值和可溶性固形物含量。

1.3.2 細菌和真菌DNA提取和PCR擴增

使用動力土壤DNA分離試劑盒從DJJS樣品中提取微生物的DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定最終DNA濃度，使用1%瓊脂凝膠電泳和分光光度法（260、280 nm波長處的光密度比）分析DNA。采用引物對338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGAC-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）通過熱循環PCR系統擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4高變區；用正向引物IT1F（5’-CTTGGTCATTAGGAGGAGTAA-3’）和反向引物IT1R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGGC-3’）擴增真菌的ITS1區。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個循環，最后72 ℃穩定延伸10 min，在4 ℃保存備用。將DNA貯存在-80 ℃下，以供下一步處理。

1.3.3 高通量測序和序列分析

根據雙端測序的重疊關系，用Flash v1.2.7軟件對每個樣品的序列進行重疊組裝，得到的Mosaic序列為原始序列數據。然后，用Trimmomatic v0.33軟件對拼接后的原始數據進行過濾，得到高質量的序列數據。最后，使用Uchime v4.2軟件識別并去除嵌合序列，獲得有效數據。使用Usearch軟件，根據相似度為97%的聚類，獲得樣品的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）編號。將OTU的序列與Silva（細菌）和Unite（真菌）的分類數據庫進行比較，并對相應的微生物物種進行注釋，比較閾值設定為70%。

1.3.4 揮發性風味化合物的提取與測定

將2.5 g樣品和7 mL飽和食鹽水放入20 mL頂空瓶，加入20 μL內標（20 μg/mL環己酮），用PTFE硅膠隔膜密封。將樣品在40 ℃平衡20 min，并將50/30 μm CAR/PDMS/DVB涂覆的纖維導入SPME裝置中，將其插入小瓶中并在60 ℃下振蕩40 min以提取和吸附揮發性風味物質。使用自動進樣器和進樣口連接，并在240 ℃下5 min內將揮發性風味物質解吸到色譜端的色譜柱。

GC條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；高純氦氣為載氣，流速1 mL/min；不分流進樣；進樣量為1 μL；進樣口溫度為240 ℃；升溫程序：40 ℃保持5 min；以5 ℃/min上升到150 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度250 ℃；電離電壓70 eV；傳輸線溫度240 ℃；掃描范圍m/z35～550；保留匹配度大于700的化合物。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 DJJS后熟階段理化性質變化

后熟過程中理化指標直接反映了DJJS的發酵狀態和發酵程度。如表1所示，在整個后熟階段，DJJS的pH值均呈下降趨勢（從5.26±0.07下降到4.62±0.01），總酸含量呈上升趨勢（從（6.42±0.16）g/kg上升到（7.72±0.01）g/kg），與之前的研究結果變化趨勢相似[18]。DJJS的pH值變化與樣品中乳酸菌生長情況密切相關。后熟初期，產酸微生物生長繁殖，體系pH值開始減小，總酸含量升高；后熟中期，可能由于生姜本身含有的姜辣素、姜酮等化合物抑制了微生物生長，體系pH值下降速率降低，最終pH值和總酸變化趨于平穩。由表1可知，整個體系處于偏酸環境，這有利于抑制部分有害菌的生長，保證DJJS品質。還原糖和灰分變化趨勢一致，在整個后熟階段均無顯著差異（P＞0.05）。后熟階段的可溶性固形物質量分數在16.97%～17.40%范圍內，在整個過程呈動態變化：后熟前期可溶性固形物含量差異不顯著（P＞0.05）；后熟中期，可溶性固形物含量開始上升；后熟后期，由于微生物代謝活動及酶活性不活躍，導致可溶性固形物含量下降。后熟階段產品的水分含量均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 DJJS后熟階段的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage

2.2 DJJS在后熟階段微生物群落的多樣性

2.2.1α多樣性分析

對DJJS后熟階段微生物多樣性和豐富度進行測定，如表2所示，DJJS中細菌菌群的Chao1指數在后熟前期降低，主要是因為在后熟前期不能夠代謝某些初級產物導致其生長受到影響[19]；后熟后期，細菌群落豐富度上升并達到最大值，此時Chao1指數為337。DJJS細菌菌群的Shannon指數隨著發酵進行先下降后上升，在后熟后期達到最大值，為4.40，說明在后熟后期DJJS細菌菌群多樣性最高。

表2 DJJS后熟階段微生物群多樣性和豐富度Table 2 Diversity and abundance of microbiota in chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage

DJJS中真菌菌群Chao1指數呈現出和細菌菌群豐富度指數一樣的變化趨勢，都在后熟前期表現出下降趨勢，在后熟第14天達到最大值，說明在后熟后期，DJJS的細菌菌群和真菌菌群豐富度都很高，后期發酵環境適宜其優勢菌群生長繁殖。DJJS中真菌菌群的Shannon指數在后熟第7天達到最大值，為3.9，說明后熟第7天的DJJS真菌多樣性最高；后熟后期，DJJS真菌菌群多樣性開始下降，可能是由于此時發酵環境氧氣不足，而且此時pH值下降，導致不耐酸和一些腐敗菌的生長受到抑制，所以造成真菌菌群多樣性降低。

由圖1可知，細菌和真菌稀釋曲線和Shannon曲線趨于平緩，表明DJJS中的物種不會隨測序數量的增多而明顯增加，說明樣品序列充分，可進行數據分析。

圖1 細菌（a、c）和真菌（b、d）稀釋性曲線和Shannon曲線Fig.1 Rarefaction curves and Shannon curves of bacteria (a and c) and fungi (b and d) in chopped pepper with shredded ginger

2.2.2 DJJS在后熟階段微生物群落分析

測序數據在門和屬兩個層面進行分類，研究DJJS在后熟階段微生物群落演替情況。如圖2所示，共鑒定出5 個優勢門（相對豐度＞1%），包括3 個細菌門和2 個真菌門。在細菌門水平上，細菌群落主要有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），分別占總細菌群的91.10%、5.94%和2.44%，此結果與其他發酵制品的16S rRNA測序結果一致[19-21]。變形菌門和厚壁菌門不僅是本實驗樣品中的優勢細菌門，也是發酵蔬菜[20]、四川泡菜[22]和小曲[23]中的優勢細菌門，擬桿菌門也廣泛存在于大曲中[24]，說明各發酵制品間存在共性。在真菌門上，優勢菌門為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），分別占總真菌群的97.61%和2.25%；在后熟階段子囊菌門一直占據主導地位，而且隨著發酵時間推移，子囊菌門的相對豐度整體呈增長趨勢，到后熟后期趨于穩定。

圖2 細菌（a）和真菌（b）群落結構在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial (a) and fungal (b)communities at the phylum level

在屬水平上，共檢測到374 個細菌屬和158 個真菌屬，其中有9 個核心細菌屬，11 個核心真菌屬（相對豐度＞1%）。由圖3可知，9 個細菌屬分別是羅爾斯頓菌屬（Ralstonia，56.03%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，10.43%）、腸桿菌屬（Enterobacter，5.98%）、歐文氏菌屬（Erwinia，4.73%）、乳球菌屬（Lactococcus，2.19%）、未指明的腸桿菌科（unspecified_Enterobacteriaceae，3.33%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，2.79%）、Wautersiella（1.20%）、氣單胞菌屬（Aeromonas，1.12%）。11 個真菌屬分別是炭疽菌屬（Colletotrichum，62.46%）、青霉菌屬（Penicillium，9.65%）、鐮刀菌屬（Fusarium，4.31%）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania，2.53%）、unspecified_Plectosphaerellaceae（2.14%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces，1.15%）、未指明酵母菌（unspecified_Saccharomycetales，1.45%）、鏈格孢屬（Alternaria，3.32%）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora，1.66%）、未指明的格孢腔菌屬（unspecified_Pleosporales，1.75%）、枝孢屬（Cladosporium，2.56%）。

圖3 細菌（a）和真菌（b）群落結構在屬水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial (a) and fungal (b)communities at the genus level

細菌屬中，羅爾斯頓菌屬和不動桿菌屬在整個后熟階段均占優勢，說明羅爾斯頓菌屬和不動桿菌屬在DJJS的后熟階段起著重要作用。隨著發酵的進行，不動桿菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬和未指明的腸桿菌屬增加，且均屬于變形菌門，據報道桿菌屬類也是米酒發酵前期主要細菌屬[25]。隨著發酵的進行，羅爾斯頓菌屬對應呈比例下降，可能是微生物之間的拮抗作用所致。羅爾斯頓菌屬從第0天的56.73%下降到第14天的52.73%，而不動桿菌屬從第0天的9.46%逐漸增加至第7天的11.61%，到發酵第14天又下降到10.54%。假單胞菌屬從開始發酵時的3%下降到后熟后期的2.79%，假單胞菌屬不能發酵糖類物質[26]，且屬于需氧菌，而DJJS后熟階段整個發酵環境屬于密閉的無氧環境，所以出現下降趨勢。有研究證實了氣單胞菌能夠利用碳水化合物[27]，穩定存在于樣品中發酵葡萄糖產酸，導致整個體系pH值呈下降趨勢、總酸呈上升趨勢，與本研究測定的pH值和總酸結果一致。

真菌屬中，優勢菌為炭疽菌屬和青霉菌屬，并且隨著炭疽菌屬的增加，青霉菌屬呈現下降趨勢。其中青霉菌屬和各酵母屬（哈薩克斯坦酵母屬、德巴利氏酵母屬、unspecified_Saccharomycetales和漢遜酵母屬）均隨著發酵時間的延長呈下降趨勢。漢遜酵母屬能產生乙酸乙酯增加產品香味[28]，該菌屬還能與葡萄糖產生磷酸甘露聚糖，對調節食品的風味有一定作用。整個發酵體系中，酵母屬占比較大，但都隨發酵的進行不斷減少。王雪雅等[29]的研究發現多種酵母菌會引起糟辣椒“生花”，因此，酵母菌屬的減少能夠避免產品出現“生花”現象。其他研究顯示德巴利氏酵母屬在發酵后期屬于優勢真菌[20,30]，而DJJS后熟后期德巴利氏酵母屬卻減少，這可能是原料差異及發酵環境不同所致。

2.3 DJJS揮發性風味物質分析

由表3可知，共鑒定出87 種揮發性化合物（匹配度＞700），其中烴類15 種，酸類10 種，醇類28 種，醛類3 種，酯類11 種，酮類5 種，酚類5 種，醚類3 種，萜烯類2 種和其他類5 種。其中，滿足P＜0.05，變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1的揮發性風味物質為差異顯著代謝物，共36 種，如圖4a所示。由圖4b可知，PC1和PC2分別占總方差的59.3%和22.2%；隨著發酵進行，樣本從第3象限順時針移動到第4象限，且不同階段明顯分離，說明在后熟階段，代謝產物變化非常迅速。由圖4c可知，隨著發酵時間的延長，揮發性風味物質種類增多，說明后期風味更豐富。

表3 DJJS揮發性風味物質種類和含量變化Table 3 Changes in the types and contents of volatile flavor substances in chopped pepper with shredded ginger

續表3

續表3

圖4 DJJS后熟階段風味代謝產物動態變化Fig.4 Dynamic changes of flavor metabolites in chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage

羅松明[31]的研究發現，泡姜中香氣物質主要是烯烴類，本研究結果也顯示烯烴類物質含量較高。這些揮發性風味物質中，欖香烯和橙花醇可能來源于生姜，其中橙花醇是玫瑰精油中的代表性成分[32]；二烯丙基二硫可能來源于大蒜揮發[11]。生姜中的姜辣素主要包括姜醇、姜酚和姜酮，與其他發酵辣椒中揮發性風味物質對比，本研究首次在剁椒中發現了表姜烯酮和束骨姜黃醇，并且束骨姜黃醇在整個后熟期呈現出持續增長的趨勢，證明生姜對本產品的風味有較大貢獻。含硫化合物是植物中一類特殊的天然產物，尤其是在辣椒、大蒜和洋蔥中，它們會產生強烈、刺鼻和刺激性的味道，各種硫化物衍生物的形成主要受發酵條件的影響[33-34]。

醇類是微生物代謝或乙醇發酵羰基的還原機制產物，是生成長鏈酯類化合物的重要前體物質。高濃度的高級醇會產生強烈的刺激性氣味，而低濃度時則會產生果香[22]。本研究檢測到的醇類中，(-)-異蒲勒醇、菖蒲烯醇、潛育醇、α-畢橙茄醇、十七烷醇、順式澳白檀醇和柳杉二醇隨著發酵的進行含量顯著升高（P＜0.05）。異蒲勒醇既是香料及化妝品工業中一種主要的原料，又是藥物及天然產物合成中有用的中間體[35]，呈樟腦和薄荷香氣，同時帶有玫瑰葉和香茅香。α-畢橙茄醇在黃金茶和白肉蓯蓉屬中也被發現，且含量較高，不易揮發；并且在白肉蓯蓉屬的葉中，α-畢橙茄醇是主要的香味貢獻物質[36-37]。柳杉二醇是抗阿爾茨海默病和抗痙攣性質的天然產物，具有顯著的藥用價值[38]，柳杉二醇具有鳳梨果油[39]、毛竹果實油[40]、黃脈石斑魚和金剛石斑魚的果實油[41]等香氣。

酯類通常來源于短鏈酸與醇的酯化反應[42]，表現出令人愉快的水果香氣[43]。其中乙酸冰片酯（松樹香）、癸酸乙酯（椰香）、乙酸香茅酯（檸檬果香、玫瑰香）、花生四烯酸甲酯和(E)-10-七烯-8-炔二酸甲酯在整個后熟過程均被檢測到。乙酸冰片酯在后熟前期逐漸升高，在第7天達到峰值。癸酸乙酯具有強烈持久的奶油香、脂肪香及椰子香[44]，能夠賦予DJJS椰香味。水楊酸甲酯有強烈的冬青油香氣，只在后熟前期出現，說明水楊酸甲酯可能來源于原料，水楊酸甲酯在提供香氣的同時，還可增加辣椒的抗氧化能力和降低腐爛率[45]。檢測到的支鏈酸酯大多來源于氨基酸代謝[46]。

酮類物質含量在后熟期間幾乎都呈先增后降的趨勢。2-庚酮呈香蕉香氣及輕微藥香氣味，甲基庚烯酮具有水果香氣和新鮮清香香氣，二者都在后熟第7天達到峰值。β-紫羅酮含量在整個后熟階段呈上升趨勢，具有紫羅蘭香味，是整個過程共有的特征香氣。有研究發現，β-紫羅酮能夠增加樣品的甜味和酸味[47]。

萜烯苷類可以水解釋放出萜烯苷元，增加產品香氣，后熟后期萜烯含量有所上升，這可能是因為結合的萜烯被水解生成揮發性香氣化合物或在發酵過程中轉化為其他化合物[48]。除此之外，在DJJS中，揮發性香氣成分還有醛類、酮類、酚類、醚類和酸類等物質。山梨酸是所有檢測到的揮發性風味物質中含量最多的，對霉菌、酵母菌和好氧性細菌有抑菌作用，能夠延長樣品的保質期。

2.4 微生物與揮發性風味化合物之間的相關性分析

對后熟階段揮發性成分發生顯著變化的物質與核心微生物進行相關分析。如圖5a所示，通過O2PLS-DA模型篩選出7 個核心微生物屬（VIP＞1且P＜0.05），其中真菌屬4 個（青霉菌屬、哈薩克斯坦酵母屬、德巴利氏酵母屬和炭疽菌屬），細菌屬3 個（羅爾斯頓菌屬、腸桿菌屬和歐文氏菌屬），說明這7 個核心微生物屬對揮發性風味有重要影響。由圖5b可知，基于Pearson相關系數揭示了36 種顯著差異揮發性風味物質與核心微生物之間的聯系。德巴利氏酵母屬與檸檬烯-6-醇、α-廣藿香烯、乙酸香葉酯、2-(4-甲基-1,4-環己二烯基)-2-丙醇和鄰苯二甲酸正辛酯呈高度顯著正相關（P＜0.001），與傘房酮呈極顯著正相關（P＜0.01）；而腸桿菌屬與檸檬烯-6-醇、α-廣藿香烯、乙酸香葉酯、2-(4-甲基-1,4-環己二烯基)-2-丙醇和鄰苯二甲酸正辛酯呈顯著負相關（P＜0.05），與傘房酮呈負相關。據報道，德巴利氏酵母屬是韓國大醬中的主要酵母[49]。德巴利氏酵母產檸檬酸，能利用烷烴作碳源。酵母菌能利用碳水化合物轉化為乙醇產生一系列的酸、酯和高級醇[50]。腸桿菌屬和歐文氏菌屬與柳杉二醇、1,2-苯二甲酸-1-丁基-2-(8-甲基壬基)酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、月桂酸、杜松醇和4,4-二甲基-3-(3-甲基-3-亞苯基-2-亞甲基雙環[4.1.0]庚烷)呈正相關。因此，腸桿菌屬和歐文氏菌屬可能對同種風味的貢獻一致，而和德巴利氏酵母屬對同種風味的貢獻相反。有報道顯示桿菌有促進醇類物質生成的作用[51]。有研究表明，這些關系可能是由微生物之間的相互作用而不是單個屬的作用引起，因此多個屬可能與單一的風味化合物有關[50]，這與本研究發現一致。

圖5 基于O2PLS-DA模型的DJJS后熟階段核心微生物（a）和微生物群與揮發性風味物質的相關性分析（b）Fig.5 Determination of core microorganisms (a) and correlation analysis between microbiota and volatile flavor substances in chopped pepper with shredded ginger at the post-ripening stage based on O2PLS-DA model (b)

3 結論

揭示DJJS在后熟階段理化特性、微生物多樣性和揮發性風味物質之間的差異，采用高通量測序和HS-SPMEGC-MS對微生物群落結構和揮發性風味物質進行分析，并基于O2PLS-DA和Pearson相關系數分析揮發性風味與優勢微生物的相關性。結果表明，從優勢屬中獲得了4 種差異顯著的真菌屬和3 種差異顯著的細菌屬；從鑒定出的87 種揮發性風味物質中篩選出36 種具有顯著差異的揮發性風味物質，發現德巴利氏酵母屬、腸桿菌屬和歐文氏菌屬與多種風味物質的變化呈現出一定相關性。本研究有助于解析DJJS菌群結構對風味的形成機制，開發基于微生物調控技術的優質剁椒生產技術，提高產品風味及品質穩定性。