鷹嘴豆抗氧化肽的分離純化、鑒定及其抗氧化活性

梁雪榮，路振康，毛曉英，吳慶智，張 建

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

自由基的過度產生會導致氧化應激，破壞DNA、蛋白質和脂質并中斷各種生理功能，引起多種慢性疾病，甚至產生急性氧中毒導致生命危險[1]。此外，過多的自由基會產生氧化作用，這可能會降低食品的質量，縮短食品的保質期[2]。合成抗氧化劑（叔丁基對苯二酚、沒食子酸丙酯和丁基羥基茴香醚等）可有效控制食物營養物質的氧化。此外，膳食中攝入的抗氧化劑也可以降低與氧化應激相關的慢性疾病風險[3]。然而，合成抗氧化劑具有損傷DNA和潛在毒性風險的缺點。因此，近年來，從天然來源中尋找新的、安全的抗氧化劑，用于食品和醫藥材料，以取代合成抗氧化劑，引起了人們極大的興趣[4]。值得注意的是，源自植物蛋白的天然抗氧化肽因其環保、可持續、無毒副作用等優點而受到廣泛關注[5]。近年來，人們從植物蛋白如鷹嘴豆等各種生物資源中鑒定并表征了具有更多營養價值的生物活性肽。

鷹嘴豆（CicerarietinumL.）為豆科（Leguminosae）重要作物，是世界上僅次于大豆和豌豆的第3大重要谷物豆類，主要用作人類食物來源，它是植物蛋白最經濟的來源之一[6]。鷹嘴豆蛋白被認為是良好的膳食蛋白質來源，是因為其氨基酸組成平衡、蛋白質生物利用度高[7]。鷹嘴豆蛋白水解物具有多種生物活性，包括抗氧化、抗菌、血管緊張素轉換酶抑制和降血脂等[8-9]。學者們通過酶解鷹嘴豆蛋白制備了多種生物活性肽，其中以具有抗氧化活性的肽研究報道較多[5,7]。因此，有關鷹嘴豆抗氧化肽的研究已成為當前一個研究熱點。然而，鷹嘴豆的高營養價值通常會受到一些抗營養因子的影響，如胰蛋白酶抑制劑、單寧、植酸和皂苷等[10]。發芽可以改善鷹嘴豆粉的功能特性和鷹嘴豆分離蛋白的抗氧化特性，并顯著減少其抗營養因子[11-12]。因此，在這項工作中，以發芽鷹嘴豆為原料，制備了鷹嘴豆抗氧化肽，采用葡聚糖凝膠對其進行分離純化，通過測定各種自由基清除能力、還原力、脂質氧化抑制能力、對自由基誘導的蛋白質和DNA損傷的保護能力評價純化肽的抗氧化活性。并且對純化肽通過鑒定合成驗證了其抗氧化活性。最后對抗氧化肽進行安全性預測，為開發具有抗氧化功能的鷹嘴豆抗氧化肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆（卡布里型）產自新疆木壘縣；pBR322質粒DNA 上海保藏生物技術中心；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、堿性蛋白酶（酶活力2.0×105U/g）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azo-bis(2-methylpropiona mide)-dihydrochloride，AAPH）、Sephadex G-75 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、三氟乙酸（均為色譜純） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DBS-100蛋白質純化系統 上海青浦滬西分析儀器廠有限公司；高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；多功能酶標儀 美國Thermo 公司；SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；L-8900型高速氨基酸分析儀 日本日立有限公司；LC-2010A HT型液相色譜儀 日本島津公司；毛細管高效液相色譜儀、電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質譜儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆多肽的制備

將挑選好的鷹嘴豆先浸泡12 h，然后在室溫下每隔6 h噴水，使其發芽2～3 d，芽長達到2～3 cm左右，制備發芽鷹嘴豆。以發芽鷹嘴豆為原料，采用低溫烘干，經高速粉碎機粉碎，過60 目篩，制備發芽鷹嘴豆粉，脫脂后于4 ℃貯存備用。

發芽鷹嘴豆蛋白的制備參考Feng Li等[13]的方法并作修改。將發芽鷹嘴豆粉與水以一定的比例混合，用0.5 mol/L NaOH溶液調節pH值至9，攪拌1 h，4000×g離心10 min，所得沉淀重復提取2 次。將3 次上清液混合，用0.5 mol/L HCl溶液調節pH 4.3，8000×g離心10 min，用蒸餾水洗滌沉淀，并將所得蛋白漿pH值調節至7.0，冷凍干燥48 h即為鷹嘴豆蛋白，-20 ℃貯存備用。

鷹嘴豆多肽的制備參考Yang Jing等[14]的方法并作修改。根據前期實驗結果得出，采用堿性蛋白酶按照底物質量濃度2 g/100 mL、酶用量8000 U/g、pH 8.0、溫度50 ℃、酶解時間60 min的條件進行酶解，酶解之后，90 ℃水浴10 min進行滅酶，7000×g離心10 min，收集上清液并冷凍干燥，-20 ℃貯存備用。

1.3.2 鷹嘴豆多肽基本成分及氨基酸的測定

水分含量測定：直接干燥法（GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》）；蛋白質含量測定：凱氏定氮法（GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》）；脂肪含量測定：索氏提取法（GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》）；灰分含量測定：灰化法（GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》）。

使用L8900高速氨基酸分析儀進行氨基酸分析。每個樣品在110 ℃用密封和真空玻璃管中的6 mol/L HCl溶液水解24 h。消化后的樣品定容至25 mL容量瓶。取5 mL消化液于60 ℃干燥，并用醋酸鈉緩沖溶液（pH 6.4）稀釋。氨基酸組成分析結果以mg/g表示。

1.3.3 凝膠色譜法分離抗氧化肽

抗氧化肽的分離參照Liu Jingbo等[15]的方法，稍作修改。將鷹嘴豆蛋白水解物以30 mg/mL的質量濃度溶解在超純水中，然后將3 mL樣品加入Sephadex G-75柱（1.6 cm×50 cm），用超純水預平衡。將流速調整為0.5 mL/min，每3.5 min將洗脫液收集到管中，280 nm波長處測定吸光度繪制峰形圖。收集出峰組分，冷凍干燥后測定抗氧化活性，并選取活性最高的組分用于后續分析。

1.3.4 鷹嘴豆純化肽分子質量分布的測定

參照Yu Yihan等[16]的方法，略有修改。使用LC-2010A HT型液相色譜議（配有紫外檢測器）；色譜條件：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm色譜柱；流動相：乙腈-水-三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V）；紫外檢測波長220 nm；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。分子質量校正曲線所用標準品（mw）：細胞色素C（12327），抑肽酶（6511），桿菌肽（1421），Gly-Gly-Gly（189）。以標準品的lgmw及洗脫時間作標準曲線（y＝-0.2343x＋6.7213，R2=0.9916）。

1.3.5 純化肽抗氧化活性的測定

分別參考文獻[17-20]的方法測定樣品的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除活性及還原力（A700nm）。

1.3.6 純化肽脂質氧化抑制能力的測定

根據Wang Jingyun等[21]的方法測定脂質氧化抑制能力，略有改動。亞油酸乳化液配制：0.28 g亞油酸，0.028 g吐溫20，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）定容至50 mL。配制不同質量濃度純化的肽液，并以谷胱甘肽（glutathione，GSH）溶液為對照組。將2.0 mL無水乙醇、5.0 mL亞油酸乳化液、4.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液與4.0 mL不同質量濃度肽液或GSH溶液混合。

采用硫氰酸鐵法測定過氧化值：0.1 mL混合溶液與體積分數75%的乙醇溶液、0.1 mL硫氰酸銨溶液（30%）、0.1 mL FeCl2溶液（0.02 mol/L；3.5% HCl溶液配制）反應3 min，在500 nm波長處測吸光度，記為A樣品0h，間隔144 h后測吸光度，記為A樣品144h。空白對照：用去離子水代替肽液重復上述步驟測定吸光度，記為A空白0h，間隔144 h后測吸光度，記為A空白144h。脂質氧化抑制率按下式計算：

1.3.7 純化肽對AAPH誘導蛋白質損傷的保護能力

參照張亮亮等[22]方法并略作修改。實驗組為0.4 mL 5 mg/mL的BSA溶液，加入0.2 mL 80 nmol/L的AAPH作為氧化劑氧化BSA，構建蛋白質氧化體系，加入0.4 mL不同質量濃度（1、3、5 mg/mL）純化肽液作為抗氧化劑。以BSA加磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）為空白組，以磷酸鹽緩沖液代替抗氧化劑為損傷組。將每組分別混合后，在37 ℃孵育24 h后，用0.02%的2,6-二叔丁基對甲基苯酚加入混合液終止反應。樣品通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行驗證。使用軟件Quantity One 4.6.2（Bio-Rad，美國）測量BSA條帶的相對強度。

1.3.8 純化肽對羥自由基誘導的DNA損傷的保護作用

參照Wang Jingyun等[21]方法并略作修改。羥自由基由Funton反應生成：取2.5 μL pBR322質粒DNA，依次加入1.25 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，1.25 μL 6 mmol/L H2O2溶液，2.5 μL不同質量濃度（1、3、5 mg/mL）純化肽液在37 ℃孵育30 min，立即加入10×DNA Loading Buffer結束反應。空白組為pBR322質粒DNA加磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0），損傷組以磷酸鹽緩沖液代替肽液。混合物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。電泳后，染色30 min，用凝膠成像儀進行成像。軟件Quantity One 4.6.2用于測定超螺旋DNA條帶的相對強度。

1.3.9 基于液相色譜-串聯質譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法鑒定抗氧化肽

委托北京百泰派克生物科技有限公司完成其結構鑒定。采用Nanoflow-UPLC（Ultimate 3000系統）色譜儀。色譜條件：納米柱：150 μm×15 cm自制柱，填充反相ReproSil Pur C18-AQ樹脂（1.9 μm，100 ?，Dr.Maisch GmbH，德國）；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脫：0～5 min，94%～91% A、6%～9% B；5～20 min，91%～86% A、9%～14% B；20～50 min，86%～70% A、14%～30% B；50～58 min，70%～60% A、30%～40% B；58～60 min，60%～5% A、40%～95% B。流速600 nL/min，進樣量5 μL。質譜條件：噴淋電壓2.2 kV，毛細管溫度270 ℃。

利用Byonic對原始MS文件進行分析，并根據樣本種類對目標蛋白數據庫進行檢索。只有高置信度鑒定肽被選擇用于下游蛋白質鑒定分析。

1.3.10 抗氧化肽的合成

委托生工生物工程（上海）股份有限公司用固相肽合成法合成（合成多肽純度＞95%）。并評估了合成肽的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除活性及還原力。

1.3.11 抗氧化肽的致敏性與毒性預測

多肽的致敏性預測采用AlgPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/index.html），預測方法基于氨基酸組成的SVM模型；毒性預測采用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php），預測方法基于Swiss-Prot[23]。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 鷹嘴豆抗氧化肽基本成分及氨基酸組成

根據前期多肽制備的最佳條件得多肽得率為55.07%，此時，多肽DPPH自由基清除率為43.71%。從表1可以看出，鷹嘴豆多肽含有較高的蛋白質含量和較低的脂肪含量。

表1 鷹嘴豆多肽基本成分Table 1 Basic components of antioxidant peptide derived from chickpea

從表2可以看出，鷹嘴豆多肽中的氨基酸組成合理，富含人體所需的各種必需氨基酸與非必需氨基酸。其中，Glu、Asp、Arg、Leu、Phe以及Lys的含量較高。有研究發現，疏水性氨基酸有著較強的自由基清除能力和抗脂質過氧化能力[24]。從表2可以看出，鷹嘴豆多肽的疏水性氨基酸含量占總氨基酸含量的38%，使鷹嘴豆抗氧化肽具有較強的抗氧化活性。由此推斷，鷹嘴豆抗氧化肽表現出較強的抗氧化活性與其氨基酸組成密不可分。

表2 鷹嘴豆多肽氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of antioxidant peptide

2.2 抗氧化肽的Sephadex G-75凝膠分離

鷹嘴豆多肽經Sephadex G-75分離后得到的3 個組分（圖1A，HCP-1、HCP-2和HCP-3），根據葡聚糖凝膠柱分離原理它們分子質量的大小應為HCP-1＞HCP-2＞HCP-3。由圖1B可知，3 個組分均表現了一定的抗氧化活性。組分HCP-3的DPPH自由基、羥自由基以及ABTS 陽離子自由基的清除能力最高，分別為（43.23±0.80）%、（57.38±1.02）%和（96.76±1.00）%，高于未純化之前鷹嘴豆蛋白水解（（42.91±1.03）%、（42.26±1.20）%、（72.23±1.00）%）。組分HCP-2的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力最差，分別為（36.10±1.80）%和（78.76±0.92）%，而HCP-1的羥自由基清除能力最差，為（42.21±0.47）%。分子質量是影響蛋白質水解物抗氧化活性的重要因素水解物，低分子質量蛋白質水解物或肽更能有效地與自由基發生反應[25]。因此，確定組分HCP-3為進一步研究對象。

圖1 鷹嘴豆肽的Sephadex G-75凝膠過濾色譜法（A）和Sephadex G-75凝膠過濾色譜法純化HCP組分的抗氧化活性（2 mg/mL）（B）Fig.1 Sephadex G-75 gel filtration chromatogram of HCP (A),and free radical scavenging capacity of three HCP fractions (2 mg/mL) (B)

2.3 純化肽的分子質量分布

由圖2和表3可知，鷹嘴豆純化肽中分子質量低于1200 Da的肽占93.82%，分子質量低于750 Da的肽占76.24%，說明純化之后得到小分子低聚寡肽含量高。肽段長短與抗氧化能力高低密切相關，分子質量在500～2500 Da的寡肽比多肽具有更強的抗氧化能力，分子質量為200～500 Da的二肽或三肽與單個氨基酸相比也表現出較強的抗氧化能力[26]。因此，推測鷹嘴豆抗氧化肽表現出的抗氧化能力與其較低的分子質量分布有關。

表3 鷹嘴豆多肽分子質量分布Table 3 Molecular mass distribution of chickpea peptides

圖2 鷹嘴豆抗氧化肽分子質量分布色譜圖Fig.2 Chromatograms showing molecular mass distribution of chickpea antioxidant peptides

2.4 純化肽的抗氧化能力

從圖3可以看出，純化肽的自由基清除能力及還原力均呈現出一定的劑量依賴性增加。DPPH自由基和ABTS陽離子自由基在體外研究中廣泛用于評估植物樣品的自由基清除特性[27]。從圖3A、B可以看出，純化肽的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力較好，尤其是ABTS陽離子自由基清除能力接近對照組GSH，分別最高達到（57.09±3.13）%和（92.93±0.18）%。羥自由基作為最強的氧自由基之一，也是評估抗氧化的重要指標。從圖3C可以看出，純化肽的羥自由基清除能力幾乎與對照組GSH（（78.55±0.85）%）的清除能力相當，最高為（76.71±0.33）%。

抗氧化劑是通過自身的還原作用，給出電子而清除自由基的。因此測定還原能力可以評估抗氧化劑提供電子或氫原子的潛力。抗氧化劑能將鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵，二價鐵進一步和三氯化鐵反應生成在700 nm波長處顯示有最大吸收峰的普魯士藍，吸光度越高則表示樣品的還原能力越強[28]。從圖3D可以看出，GSH展現了最高的還原力，最高達到1.88±0.13。而純化肽的還原力最高達到0.58±0.11，顯著低于對照組GSH。但在質量濃度為1 mg/mL（0.10±0.01）時顯著高于豌豆肽（0.012，1 mg/mL）[29]。以上結果表明純化肽具有較好的清除自由基的能力和還原力。

圖3 純化肽不同質量濃度對DPPH自由基（A）、ABTS陽離子自由基（B）、羥自由基（C）的清除能力及還原能力（D）Fig.3 DPPH radical (A),ABTS cation raical (B),and hydroxyl radical scavenging capacity (C) and reducing power (D) of purified peptide at different concentrations

2.5 純化肽的脂質氧化抑制能力

采用體外脂質過氧化模型評估純化肽的抑制活性。將不同質量濃度的純化肽與GSH比較144 h。結果表明（圖4），與對照組（無樣品）相比，純化肽顯著延緩脂質過氧化，5 mg/mL的純化肽（脂質氧化抑制率61.74%）抑制脂質過氧化的能力最強，但其對脂質過氧化的抑制能力仍稍弱于對照GSH（脂質氧化抑制率73.50%）（P＜0.05）。雖然天然抗氧化劑不如合成抗氧化劑有效，由于合成抗氧化劑的使用具有嚴格的限制[30]，且蛋白質水解物的摻入可以為食品賦予其他理想的營養和功能特性。因此，發芽鷹嘴豆多肽有可能替代合成抗氧化劑。

圖4 不同質量濃度純化肽對脂質氧化的抑制能力Fig.4 Inhibitory activity of different concentrations of purified peptide on lipid oxidation

2.6 純化肽對蛋白質氧化損傷的保護作用

AAPH是一種疊氮化合物，是公認的自由基誘導劑。在37 ℃，pH 7.0條件下，AAPH會分解產生過氧自由基[31]。因此，在37 ℃條件下，AAPH可使BSA發生氧化損傷，通過AAPH體系產生過氧自由基，誘導蛋白質的氧化損傷，考察不同質量濃度的純化肽對蛋白質損傷的保護作用，結果見圖5。添加AAPH之后，BSA條帶減弱，而添加不同質量濃度的純化肽之后，BSA條帶逐漸增強，說明鷹嘴豆抗氧化肽對蛋白質氧化損傷具有保護作用，并且具有濃度依賴性。

圖5 不同質量濃度純化肽對蛋白質損傷的保護作用Fig.5 Protective effects of different concentrations of purified peptide on protein damage

2.7 純化肽對DNA氧化損傷的保護作用

采用羥自由基誘導DNA氧化損傷，考察純化肽對DNA氧化損傷的保護作用，結果見圖6。未被羥自由基損傷的原質粒pBR322 DNA的超螺旋條帶較強，而加入Fe2＋和H2O2反應后，DNA超螺旋條帶顯著減弱，表明羥自由基對pBR322 DNA有損傷作用。但加入純化肽后，超螺旋結構的DNA逐漸增多，并且隨著樣品濃度逐漸增加，以超螺旋形式存在的DNA顯著增多。這些結果表明，該多肽能顯著抑制羥自由基誘導的DNA氧化損傷。這可能是因為該多肽可以阻止Fe2＋和H2O2反應，并通過提供氫原子和電子而直接清除羥自由基，進而保護質粒DNA不被損傷[32]。在王悅等[33]研究中也有類似的發現。

圖6 不同質量濃度純化肽對DNA損傷的保護效果Fig.6 Protective effects of different concentrations of purified peptide on DNA damage

2.8 抗氧化肽的鑒定與合成

采用LC-MS/MS法檢測鷹嘴豆抗氧化肽純化之后肽段的組成及其序列，本檢測方法的掃描范圍為350～5000 Da。質譜采集的raw文件，經過軟件Byonic數據庫檢索，得到1633 條肽段，選取了得分較高的5 條肽段分別為GGLSFISPSEKQPRH、DHLDFSDETDTK、AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE、KEGTLAPF，其分別來源于（A0A1S2XSB9_CICAR）（251-265）、（A0A1S2Y9D7_CICAR）（20-31）、（A0A3Q7XXP6_CICAR）（229-242）、（A0A1S2Y850_CICAR）（40-49）、（A0A1S2YBR2_CICAR）（390-397）。

使用BIOPEP數據庫（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）進行了肽序列搜索，未找到AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE肽序列。因此，這兩條從鷹嘴豆中分離的肽序列被認為是新的。對這兩條肽序列進行了合成（純度＞95%），并對其DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基清除活性、還原能力等進行了評價，它們的抗氧化活性各不相同，如表4所示。可以看出，兩條肽序列都有較好的自由基清除能力，肽SDALDKIRFE的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力均高于肽AGDTHLGGEDFDNR，與肽AGDTHLGGEDFDNR的羥自由基清除能力和還原力不具有顯著差異。兩條肽的DPPH自由基和羥自由基清除能力均高于同樣濃度下純化多肽，其ABTS陽離子自由基清除能力和還原力略低于同濃度下純化多肽。這可能是由于多肽分子質量和氨基酸組成不同導致。經氨基酸組成分析結果可知，肽AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE的疏水性氨基酸含量分別占43%、40%，因而其具有較好清除DPPH自由基和羥自由基的能力。大量研究表明，肽的抗氧化活性與其氨基酸序列、組成、分子質量和疏水性密切相關[14]。抗氧化肽的分子質量是決定抗氧化活性的關鍵因素之一。表4中鑒定出分子質量相對較低（1194～1504 Da）的活性肽，由10～14 個氨基酸殘基組成，這一發現與報道一致[34]，即大多數抗氧化活性的多肽含有2～20 個氨基酸，分子質量低于6000 Da，其抗氧化活性遠比它們的親本蛋白質分子（20～50 個氨基酸）具有更強的抗氧化活性。Guo Hang等[35]研究蜂王漿抗氧化肽的構效關系，發現在肽序列的C-末端含有Lys殘基或Arg殘基的肽序列Phe-Lys、Phe-Pro-Arg表現出較強的抗氧化活性，本實驗從鷹嘴豆蛋白分離純化的抗氧化肽序列AGDTHLGGEDFDNR（Asp-Asn-Arg）與上述肽段的相似結構，所以該條多肽的抗氧化活性可能與C-末端含有的Arg殘基有重要關系。Agrawal等[36]首次從珍珠粟蛋白水解物分離并表征了一種具有較好抗氧化能力的肽SDRDLLGPNNQYLPK，認為該肽具有抗氧化能力與肽序列中含有疏水性氨基酸Gly，Leu和Pro的存在有關。Feng Yanxia等[37]從板栗蛋白水解物中鑒定出5 種抗氧化肽VYTE、TKGQ、MMLQK、TPAIS和VSAFLA，其中VYTE和VSAFLA顯示出最高的ABTS陽離子自由基清除能力，認為肽VYTE的抗氧化能力與復合結構VY的存在有關，肽VSAFLA的抗氧化能力與疏水性氨基酸（例如，N末端的Val；C末端的Ala；以及部的Ser、Ala、Phe和Leu）的存在有關。

表4 LC-MS/MS鑒定肽的抗氧化活性和特征Table 4 Antioxidant activity and characteristics of peptides identified by LC-MS/MS

2.9 毒性和致敏性預測

自然界中，某些多肽具有毒性，如鵝膏毒肽類、蜂毒肽類、蛇毒肽類等，有些多肽毒性可致死[38]，有些多肽具有致敏性[39]。因此，有必要對鷹嘴豆蛋白源的抗氧化肽AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE進行安全性評估，結果見表5。由檢測結果可知，基于氨基酸序列預測，AGDTHLGGEDFDNR、SDALDKIRFE無致敏性、無毒性，安全性較高。因為所用預測結果是利用數據庫預測得來，所以和最終結果會存在偏差。若要進一步研究所合成肽在人體是否具有毒性或者致敏性則需進行細胞或者體內實驗。

表5 肽序列的安全性預測Table 5 Safety prediction of synthetic peptides

3 結論

以發芽鷹嘴豆為原料，對其水解后的抗氧化肽進行分離純化，并通過各種方法評價其抗氧化活性。結果表明，發芽鷹嘴豆純化肽具有較好的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基清除能力和還原力。并且由于其高含量的疏水性氨基酸而顯著抑制脂質過氧化，保護自由基誘導的蛋白質和DNA損傷。經預測，合成肽無毒性與致敏性。本研究可為從發芽鷹嘴豆中制備抗氧化肽提供理論依據，同時提高鷹嘴豆的利用價值。可進一步研究這些肽在食品工業和體內模型中的應用，以證實實驗的假設。