當歸四逆加吳茱萸生姜湯調節雷諾病的系統藥理學和先導化合物研究

潘中藝，王曦廷，張秀平，倪勝樓，劉旎，傅延齡

1.北京中醫藥大學，北京 102488；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029

雷諾病是肢端小血管痙攣性或功能性閉塞引起的局部缺血現象，表現為陣發性四肢末端(手指為主)對稱性間歇發白與發紺，感覺異常，伴有指(趾)疼痛[1]。其發病率與性別、地域及氣候條件、職業環境等因素相關[2-3]，最新數據顯示，該病全球發病率為3%～5%[4]。

雷諾病屬于自主神經系統疾病范疇，其發病機制目前尚未完全明了，一般認為與交感神經功能紊亂、血管敏感性因素、血管壁結構因素、炎癥介導的內分泌因素以及遺傳因素等有關?，F代研究表明，雷諾病好發部位如手指、腳趾等處具有豐富的微小動脈和微小靜脈吻合，繞過毛細血管而直接連接。微血管具有較多的交感神經分布，環境寒冷時，交感神經活動反射性增加，引起微血管痙攣。雷諾病患者的血管對寒冷刺激的敏感性增高，微血管痙攣更加強烈，引起肢端局部缺血，皮膚蒼白；痙攣后血管擴張，動脈、靜脈及動靜脈吻合口的血流紊亂，血液瘀滯，皮膚呈現藍色或發紺[5]。此外，內分泌因素也被認為是雷諾病的重要發病因素之一。內皮細胞功能失調，導致血管舒張劑如一氧化氮和前列環素的活性降低，血管收縮內皮素-1釋放增加。炎性介導途徑激活導致上游動脈血管舒張功能受到影響，局部毛細血管血供受阻[6]。皮膚血管中α-2腎上腺素能的增加也會使血管舒縮功能受到影響[7-8]。

本病的西醫常規治療包括藥物治療和非藥物治療。首選非藥物治療，如規避寒冷環境、心理壓力過大等誘發因素。當非藥物治療無法有效降低血管痙攣發作的嚴重程度并改善生活質量時，可進行藥物治療。西醫常用藥物有鈣通道阻滯劑以及人工合成前列環素(伊洛前列素)[9]，但目前尚缺乏高質量的隨機雙盲試驗[10-11]。

中醫學認為，雷諾病屬于“厥逆”“寒厥”“痰厥”“水厥”“血痹”等范疇[12]，其核心病機為血虛寒凝，目前可見到臨床醫家使用當歸四逆湯治療雷諾病的成功案例[13-15]，對于久病頑疾患者，當歸四逆加吳茱萸生姜湯亦有奇效[16]?，F代藥理學研究認為，該方能促進外周血液循環，使末梢循環障礙改善，對慢性疼痛及疼痛伴有肢冷畏寒的多種寒性疼痛有鎮痛效果[17]。筆者通過文獻總結，預測本方治療雷諾病機制可能與抑制交感神經興奮，改善微循環，增加血流量，調節血管內皮舒縮功能，提高機體免疫，調節炎癥細胞因子等途徑有關，其起效作用途徑有待進一步探討。

在本研究中，筆者基于網絡分析、富集分析、分子對接和藥效團模擬方法，對當歸四逆加吳茱萸生姜湯進行了系統藥理學研究。通過檢索在線中藥數據庫，獲取并篩選此方中的中藥、中藥化合物及靶點信息，通過富集分析揭示該方的系統藥理機制，通過機器學習和分子對接，實現了有效活性成分的篩選和虛擬驗證。結果表明，該方可調節HIF-1信號通路、cAMP信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、Th17細胞分化、酪氨酸代謝、神經活性配體-受體相互作用、肌萎縮性側束硬化等，方中的(-)-Medicocarpin、Semilicoisoflavone B、Yinyanghuo D等成分，可以作為治療雷諾病的先導化合物進行下一步研究。

1 資料與方法

1.1 中藥化合物成分收集與篩選從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)和中醫藥綜合數據庫(traditional Chinese medicine intergrated database，TCMID)檢索中藥化合物成分。檢索詞為：“當歸”“桂枝”“白芍”“細辛”“通草”“甘草”“大棗”“吳茱萸”“生姜”。使用薛定諤軟件(Schr dinger，Maestro 11.9)的ADMET分析模塊，預測各化合物的類藥性等分子屬性，將其計算的口服吸收百分數(percent human oral absorption，PHOA)及類藥性五原則(Rule of Five，ROF)指數作為潛在活性成分而篩選標準。根據文獻研究[18]，篩選閾值為PHOA>80%，并滿足類藥性五原則。

1.2 化合物靶點數據庫構建及網絡分析針對虛擬篩選后的中藥化合物，從TCMSP中獲取化合物的靶點信息。使用Cytoscape 3.6軟件，構建中藥化合物-靶點網絡。使用Network Analysis模塊，進行網絡圖分析。

1.3 通路富集與上游調控因子預測分析在“化合物-靶點”數據基礎上，對靶點名稱進行ID轉換，選擇Human注釋庫，對靶點信息進行過濾。使用Metascape數據庫(https：//metascape.org/gp/index.html)對本方調控的靶點集合進行京都基因與基因組百科全書通路分析及基因本體富集分析以及蛋白互作網絡分析。使用ChEA3數據庫(https：//maayanlab.cloud/chea3/)將處方的靶點進行上游轉錄因子分析。

1.4 分子對接首先，從TCMSP及PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取化合物核心成分3D分子結構；從PDB數據庫(https：//www.pdbus.org/)獲取AGTR1結構。其次，使用薛定諤軟件，對化合物結構進行預處理，生成多個化合物構象。對蛋白結構進行加工(去除水分子，添加氫原子)，使用Sitmap模塊探索并定義蛋白結構中結合位點。隨后，使用LigandDock模塊，對化合物及蛋白進行分子對接模擬，使用Docking score函數進行對接結合能打分。一般分值越低則結合情況越好。同時，使用可視化分析模塊，觀察分子與AGTR1的結合姿態。

1.5 藥效團模擬通過檢索文獻，收集目前治療雷諾氏病的一般藥物。從Pubchem數據庫收集藥物的結構。使用薛定諤軟件中的Phrase模塊，將這些藥物作為陽性藥物組，設置藥效團的數量為2～7。生成藥效團假設模型。選擇假設的藥效團模型，對經過PHOA與ROF篩選的中藥化合物進行藥效團模型篩選。

2 結果

2.1 中藥化合物核心成分檢索到“當歸”中化合物88個，“桂枝”中187個，“白芍”中41個，“細辛”中161個，“通草”中8個，“甘草”中165個，“大棗”中74個，“吳茱萸”中125個，“生姜”中199個，共收集1 024個化合物。去除中藥間的重復化合物后，共獲得751個化合物。隨后，基于PHOA與ROF值篩選，初步篩選得到696個化合物成分作為潛在活性成分。

2.2 調控網絡對696個化合物，使用TCMSP獲取“化合物-靶點”數據，共得到6 624對原始數據。通過靶點去重過濾，共獲得401個特異性靶點，形成“化合物-靶點”5 446調控對。使用Cytoscape構建“化合物-靶點”藥理調控網絡，見圖1。

圖1 當歸四逆加吳茱萸生姜湯的“化合物-靶點”調控網絡圖

2.3 富集通路對差異基因進行GO分析。統計每個GO條目中所包括的差異基因個數，并用超幾何分布算法計算每個GO條目中差異基因富集的顯著性。計算的結果會返回一個富集顯著性的P值，值越低說明差異越顯著。可以根據GO分析的結果結合生物學意義，挑選用于后續研究的基因。本次結果共計基因 401 個，其中有生物學過程(biological process，BP)注釋的基因共計217 個；細胞組分(cellular component，CC)注釋的基因共計221個；分子功能(molecular function，MF)注釋的基因共計224個。對GO富集分析結果中生物學過程，細胞組分，分子功能中的條目繪制條形圖，在同一張圖中展示GO三大類結果中最顯著的GO條目，見圖2。對GO富集分析結果中P值最小的30個條目繪制氣泡圖，展示GO富集分析結果中最顯著的條目，以及對應的分類(BP，CC，MF；見圖3)。KEGG富集分析利用超幾何分布計算KEGG Pathway中每個通路與本次差異基因的關聯度，對差異基因KEGG富集分析結果進行氣泡圖展示，見圖4。利用KEGG數據對差異基因進行通路分析，并利用超幾何分布算法計算每個通路中差異基因富集的顯著性，P值越小，說明對應的通路與本次差異基因的關聯程度越高。通過差異基因的通路分析，可以獲取差異基因顯著相關的通路，從而推斷實驗設計條件可能和哪些通路的改變有關。

注：圖中Y軸為-log10(pvalue)，條形圖高度越高，對應的P值越小。不同的顏色分布對應BP，CC，MF

注：圖中Y軸對應GO的條目，X軸對應EnrichmentScore，不同的形狀對應不同的GO分類(BP，CC，MF)，點的大小對應GO條目中差異基因的多少，氣泡顏色由紫-藍-綠-紅變化，其富集pValue值越小，顯著程度越大

注：圖中X軸表示富集度，Y軸表示富集的通路。圖中點越大表示落入該通路的基因越多，氣泡顏色由紫-藍-綠-紅變化，其富集pValue值越小，顯著程度越大

2.4 活性成分分子對接與藥效團模擬驗證由于目前治療雷諾病尚無特定的靶向藥物，因此我們使用藥效團模擬方法，在整合了目前治療雷諾病的一般治療小分子藥物基礎上，構建了陽性藥物藥效團模型，見表1。選擇第一個藥效團模型AAH，對本方的化合物進行篩選。隨后，結合有關雷諾病的機制文獻，確定以AGTR1靶點作為調節雷諾病的關鍵靶點，采用分子對接模擬，分析潛在調節AGTR1有效成分。結果表明，共94個活性成分分值低于-5，表明較好的結合活性，表2。觀察(-)-Medicocarpin與AGTR1結合模式，見圖5，(-)-Medicocarpi與AGTR1的氨基酸殘基ASP263和ASP281可以形成較好的鍵合力，且其對接得分為-8.691，表明(-)-Medicocarpin與AGTR1具有較好的結合活性。

表1 目前治療雷諾病的一般小分子藥物

注：A：(-)-Medicocarpin；B：Semilicoisoflavone B；C：Yinyanghuo D

表2 方劑中的潛在活性化合物

3 討論

雷諾病發病機制尚未完全明確，研究認為，交感神經功能紊亂、炎癥介導的內分泌因素等在其發病中起重要作用。中醫對雷諾病具有獨到見解，多數醫家認為本病屬本虛標實，以稟賦不足、飲食失調、情志不暢等為病因，氣血失榮失暢，寒邪痹阻經絡，四肢失于溫養為核心病機，臨床常運用當歸四逆湯、黃芪桂枝五物湯、陽和湯等進行治療，取得一定的治療效果，值得進一步研究[19]。

當歸四逆加吳茱萸生姜湯出自《傷寒論》，全方由當歸、芍藥、炙甘草、通草、桂枝、細辛、生姜、吳茱萸、大棗9味組成。方中當歸甘溫，補血通脈；通草通利血脈；細辛溫化寒飲；吳茱萸溫中化飲；合生姜止嘔，具有溫陽、養血、通絡的功效，用于治療太陽太陰合病，寒飲內停、頭痛、腹痛、寒疝等病[16]。臨床經驗證明，當歸四逆加吳茱萸生姜湯可廣泛應用于手足冷證、帕金森病、痛經、老年類風濕性骨關節伴骨質疏松、寒冷性多形性紅斑、更年期障礙等許多疾病，亦有不少醫家運用本方治療雷諾病[17]。現代藥理學研究表明，當歸可促進造血細胞的分化和增殖，對造血微環境形成刺激，促使其釋放造血生長因子，并具有一定的抗炎作用[20]；吳茱萸具有抗炎、鎮痛、中樞保護、抗潰瘍、止吐止瀉等藥理作用[21]；細辛具有良好的鎮靜、抗驚厥、解熱、鎮痛、抗炎、抗變態反應的作用[22]。由于雷諾病發病與炎癥反應、神經功能紊亂等因素密切相關，因此當歸四逆加吳茱萸生姜湯治療雷諾病具有較為明確的理論基礎與臨床經驗，但其具體生物學機制尚未明確。

為了初探當歸四逆加吳茱萸生姜湯治療雷諾病的潛在生物學機制，本研究對當歸、芍藥、炙甘草、通草、桂枝、細辛、生姜、吳茱萸、大棗的活性成分及其靶點進行篩選。在所得到的696種活性成分中，分子對接模擬表明有94個化合物的分子對接得分較好，這些化合物或可通過調節AGTR1，進而介導外周血管收縮，增加外周血管阻力，使心肌收縮力增強，心排血量增強，增強微循環以調節雷諾氏現象。其中，(-)-Medicocarpin、Semilicoisoflavone B及Yinyanghuo D等小分子化合物與AGTR1的對接得分表現出較好的結合活性。其中(-)-Medicocarpi與AGTR1的氨基酸殘基ASP263、ASP281可以形成較好的鍵合力，可為未來藥物研發提供研究支持。隨后進一步使用藥效團模型篩選方法觀察本方組分的潛在藥效團位點，結果表明，(-)-Medicocarpin具有較好的陽性藥相似藥效團位點。

通過對當歸四逆加吳茱萸生姜湯的GO分析，得到生物學過程、細胞組分、分子功能GO富集條目中結果最顯著的10條。由此可推測，當歸四逆加吳茱萸生姜湯對雷諾病的治療作用與吡哆醛磷酸結合、甘氨酸結合、氨基酸結合、蛋白質同源二聚體活性、G蛋白偶聯受體活性等生物學過程及線粒體基質、線粒體、外泌體、細胞連接等細胞組分相關，受預激抑制、乙醇應激反應、多巴胺代謝過程、谷胱甘肽代謝過程、抑制性突觸后電位等分子功能影響。研究結果與自主神經功能紊亂、血管異常、血流動力學改變等雷諾病常見發病機制一致[23]。

通過對當歸四逆加吳茱萸生姜湯的KEGG通路富集分析，得到關聯度較高的信號通路條目30條，包括HIF-1信號通路、cAMP信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、Th17細胞分化、酪氨酸代謝、神經活性配體-受體相互作用、肌萎縮性側束硬化等。KEGG信號通路富集分析中，Count值較高的通路與氨基酸代謝、免疫反應等相關，提示氨基酸代謝紊亂與神經免疫反應或是引發雷諾病的重要因素。

此外，有學者研究發現，CGRP 具有強大的擴血管作用，與G蛋白偶聯的CGRP受體結合，可激活腺苷酸環化酶，使細胞內第二信使環磷酸腺苷升高，進而使血管平滑肌松弛，在雷諾病的發病過程中有著重要作用[24]。富集通路中的HIF-1信號通路，是對缺氧(低氧水平)應答的主要調節通路，缺氧與人類諸多重大疾病的病理生理都有關聯，包括心肌和腦缺血、癌癥、肺動脈高壓、先天性心臟病和慢性阻塞性肺疾病等。有研究表明，缺氧誘導因子-1作為一種異二聚體轉錄因子，由缺氧誘導因子-1α和缺氧誘導因子-1β兩個亞單位組成，其中缺氧誘導因子-1α可能為雷諾病抗缺血治療的新標記物[25]。環磷酸腺苷信號通路與細胞外刺激如神經遞質、激素、炎癥刺激、應激、腎上腺素、去甲腎上腺素等密切相關。

本研究運用網絡藥理學的方法挖掘闡述了當歸四逆加吳茱萸生姜湯的活性化合物、調節靶點以及對雷諾病治療的多成分-多靶點-多途徑的機制，初步推斷當歸四逆加吳茱萸生姜湯可能通過調節HIF-1信號通路、cAMP信號通路、IL-17信號通路等血管擴張而改善雷諾病。分子對接和藥效團模擬結果顯示，甘草中的(-)-Medicocarpi、Yinyanghuo D與吳茱萸中的Goshuyuamide II等可以作為治療雷諾病的潛在有效成分，可進一步進行先導化合物的藥物研發。本研究聯合采用了網絡藥理學、分子對接與藥效團模擬的方法，揭示了當歸四逆加吳茱萸生姜湯調節雷諾病的系統藥理學機制，并有助于進一步研發先導化合物。