按壓心俞穴調節心肌缺血模型大鼠細胞凋亡的作用機制*

張晨晨，朱曉晴，李甜，王聰聰，李鐵浪

湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

心肌缺血是由于心臟血液供需不平衡引起的病理狀態，持續的缺血缺氧導致心功能紊亂，嚴重者引起心肌梗死、心力衰竭甚至死亡[1-2]。流行病學顯示，中國心血管病(cerebrovascular disease，CVD)患病率和死亡率處于持續上升階段，目前，心血管病是城鄉居民死亡的首要原因[3]。細胞凋亡是心肌細胞損傷的表現，廣泛參與心肌組織病理過程[4]，調節細胞凋亡可能有利于阻止心肌缺血缺氧進展性損傷。

研究表明，按法通過對特定穴位進行刺激可以改善心肌缺血狀態。心俞穴是背俞穴之一，刺激心俞穴可以調節心臟功能[5-6]。課題組前期研究發現，按壓心俞穴可以改善心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)模型兔心臟功能，延緩心力衰竭進程[7-8]，但其作用機制有待進一步研究。因此，本研究通過制備心肌缺血大鼠模型，觀察按壓心俞穴對心肌損傷的調節作用是否與細胞凋亡相關，為臨床治療本病提供實驗支持。

1 材料

1.1 動物SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質量250～280 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0004，動物實驗經湖南中醫藥大學動物中心實驗室倫理審批通過，倫理編號：LL2020102301。大鼠分籠飼養于湖南中醫藥大學動物中心實驗室，每籠3只，規律飲食，晝夜節律光照，飼養溫度為24～26 ℃，相對濕度 50%～70%。

1.2 藥物與試劑異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號：R510-22-16，規格：100 mL)；異丙腎上腺素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：I129810)；鹽酸地爾硫卓(上海麥克林生化科技有限公司，批號：D835096)；生理鹽水(廣西裕源藥業有限公司，批號：H45020975)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司，批號：11684817910)；破膜工作液、PBS緩沖液(皮諾飛生物科技有限公司，貨號：PN00014、PN0001)；DAPI染色液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C1006)；抗熒光淬滅封片劑(美國Southern Biotech公司，批號：0100-01)；5×蛋白上樣緩沖液[四維加生物科技(武漢)有限公司，批號：8190011128]；甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，純度≥99.5%，國藥編號：10014118)；大鼠心肌肌鈣蛋白-Ⅰ(cardiac troponin-Ⅰ，cTn-Ⅰ)ELISA試劑盒、大鼠肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase，MB form，CK-MB)ELISA 試劑盒、活化的半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease 3，C-Caspase 3)抗體(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E08594r、CSB-E14403r、CSB-PA148736)；B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)多克隆抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X，Bax)多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：12789-1-AP、50599-2-Ig)。

1.3 儀器瑞沃德R500通用型呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；ECG-2303B型數字心電圖機(廣州市三銳電子科技有限公司)；KE0003087型移液槍、D3024R型臺式高速冷凍離心機(大龍興創實驗儀器北京股份公司)；Epoch型酶標檢測儀(美國BioTek公司)；DYY-6C型電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；KZ-Ⅱ型高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；Nikon Eclipse型正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；自制按法刺激器(專利號：201720875963.5)

2 方法

2.1 動物分組與造模將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、按法組和鹽酸地爾硫卓組，每組15只。除空白組外，其余3組大鼠參照文獻記錄的方法建立心肌缺血模型[9]，具體如下：于大鼠腹部皮下注射異丙腎上腺素2 mg·kg-1(濃度10 g·mL-1)，每日1次，連續注射14 d。造模前和造模結束后，用呼吸機麻醉(異氟烷麻醉：誘導濃度4%，維持濃度2%)大鼠后仰臥固定，連接數字心電圖機，記錄大鼠造模前和造模后Ⅱ導聯心電圖變化，并計算J點位移變化(無論升高或者降低，取其變化的絕對值)，測定五個連續波型，取其平均值，以J點位移變化值>0.1 mv視為造模成功[10-11]。

2.2 干預方法大鼠造模完成后正常飼養并分別給予相應治療。按法組：將大鼠俯臥位放置固定，操作部位局部備皮，用自制的按法刺激器，根據實驗研究得出的按法起效最佳參數[12](力量0.7 kg、時間7.5 min、頻率10次·min-1)，在雙側心俞穴上進行按壓刺激，每天1次，每次間隔24 h，共干預7次；鹽酸地爾硫卓組大鼠腹腔注射鹽酸地爾硫卓 1.5 mg·kg-1(濃度10 g·L-1)，每天1次，每次間隔24 h，共注射7次，空白組和模型組不予處理。

2.3 心電圖監測根據肢體導聯順序，連接數字心電圖機，于造模前、造模后、治療后分別檢測心電圖，記錄J點位移變化值。

2.4 心肌組織HE染色腹主動脈采血后，立即解剖暴露心臟，剪掉心耳，心臟注射1 mL生理鹽水灌流2次后，取下全心，剪去多余組織，將其固定于 40 ng·L-1多聚甲醛溶液中24 h后，將固定好的心肌組織經脫水、包埋后制備心肌組織石蠟切片，進行HE染色常規操作，顯微鏡下觀察心肌組織病理形態學改變情況。

2.5 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡率取心肌組織制備石蠟切片，經過抗原修復、血清封閉、滴加試劑，DAPI復染細胞核后封片，切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。光鏡下正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈深淺不一的熒光綠色。切片于光鏡下400倍放大，應用Image J圖像分析系統進行圖像分析，每張片隨機選取5個視野，對凋亡陽性細胞進行計數，以心肌凋亡陽性細胞數占總心肌細胞數的百分比作為心肌細胞凋亡率。

心肌細胞凋亡率= 凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100%

2.6 ELISA檢測大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ的含量呼吸機異氟烷維持麻醉下，將大鼠仰臥固定于手術臺上，腹主動脈采血，靜置2 h后離心，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液分裝后于-20 ℃ 保存。將血清樣本從-20 ℃冰箱取出，解凍后的樣本應再次離心，然后按照試劑盒說明書進行檢測。

2.7 Western Blot檢測大鼠心肌組織中C-Caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平取新鮮心臟組織，置于凍存管并迅速移至液氮中凍存，再移至-80 ℃ 冰箱中保存以備檢測。從-80 ℃冰箱中取出標本，經過蛋白提取、總蛋白變性、制膠、灌膠、電泳、轉膜、封閉、抗體孵育后發光檢測，最后將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標條帶的光密度值。

3 結果

3.1 各組大鼠心電圖J點位移變化值比較與空白組比較，模型組大鼠的J點位移變化值增加且>0.1 mv，差異有統計學意義(P<0.01)，提示心肌缺血模型建立成功。與模型組比較，按法組、鹽酸地爾硫卓組J點位移變化值降低，差異有統計學意義(P<0.01)，提示按壓心俞穴能夠改善心肌缺血模型大鼠心肌損傷狀態。見表1。

表1 各組大鼠心電圖J點位移變化值比較

3.2 各組大鼠心肌組織病理變化比較空白組心肌組織形態基本正常，細胞核完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清楚，心肌結構無明顯病理改變。與空白組比較，模型組大鼠心肌組織形態結構破壞嚴重，心肌纖維大部分溶解、壞死，大量膠原纖維滲出，心肌細胞大小不一，呈萎縮、變性改變；與模型組比較，按法組和鹽酸地爾硫卓組均能改善心肌纖維的纖維化狀態，減少心肌細胞壞死程度，心肌損傷明顯改善，見圖1。

注：A：空白組；B：模型組；C：按法組；D：鹽酸地爾硫卓組；箭頭a：細胞核；箭頭b：心肌纖維；箭頭c：膠原纖維；箭頭d：肥大的心肌細胞；箭頭e：肥大增生的心肌細胞

3.3 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較與空白組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，按法和鹽酸地爾硫卓組大鼠心肌細胞凋亡率下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2、圖2。結果表明，按壓心俞穴能減少心肌細胞凋亡，改善心肌損傷。

注：A：空白組；B：模型組；C：按法組；D：鹽酸地爾硫卓組；箭頭a：正常細胞；箭頭b：凋亡細胞

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較

3.4 各組大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ含量比較與空白組比較，模型組大鼠血清 CK-MB、cTn-Ⅰ含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，按法組和鹽酸地爾硫卓組大鼠血清CK-MB、cTn-Ⅰ含量降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。結果表明，按壓心俞穴能明顯改善心肌損傷。

表3 各組大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ含量比較

3.5 各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達水平比較與空白組比較，模型組Bax、C-Caspase 3蛋白表達水平上調，Bcl-2蛋白表達水平下調，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，按法組和鹽酸地爾硫卓組Bax、C-Caspase 3蛋白表達水平下調，Bcl-2蛋白表達水平上調，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。結果表明，心肌缺血模型大鼠存在明顯的心肌組織細胞凋亡，按法干預可明顯抑制模型大鼠的心肌組織細胞凋亡。見圖3。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、C-Caspase 3、Bcl-2蛋白表達水平比較

注：A：空白組；B：模型組；C：按法組；D：鹽酸地爾硫卓組

4 討論

心肌缺血是心臟的一種病理狀態，表現為心臟血液供應減少而導致缺氧，持續缺血缺氧會產生炎癥反應，釋放大量活性物質，引起心肌細胞水腫、凋亡，進而導致心臟功能障礙，造成繼發性損傷[13]。本研究采用異丙腎上腺素制備心肌缺血模型，是由于異丙腎上腺素可引起心肌快速收縮，心臟做功增加，導致心肌耗氧過多，出現心肌缺血和壞死[14]。

心肌缺血一旦發生，心電圖也隨之改變，心電圖中J點位移變化引起ST段改變，可反映心肌缺血性損傷程度[15]。隨著心肌缺血的持續存在，心肌細胞大量凋亡或者壞死，血液中cTn-Ⅰ、CK-MB水平急劇上升，而cTn-Ⅰ、CK-MB是反映心肌細胞損傷程度的重要指標[16]。心肌缺血持續發生，造成心肌細胞不可逆的傷害，細胞凋亡也隨之發生[17]。Bcl-2 家族包括促細胞凋亡和抗細胞凋亡兩大類，主要參與細胞凋亡信號接受和傳遞的上游環節，與線粒體膜的通透性雙向調節相關。當促凋亡蛋白收到凋亡信號時，可使線粒體釋放細胞色素C來激活下游Caspases引起細胞凋亡，而抗凋亡蛋白通過抑制促凋亡蛋白來抑制細胞凋亡，在調節細胞凋亡中起關鍵性作用[18]。Bcl-2是抗凋亡蛋白，能抑制如輻射、高溫以及部分藥物誘導等因素引起的細胞凋亡，還可通過調節Ca2+濃度和抗氧化作用保證細胞存活[19-20]。Bax作為一種細胞傳感器，位于線粒體表面，通過破壞Bcl-2蛋白的功能引起細胞凋亡[21]。Caspase家族蛋白活化是細胞凋亡的下游環節，C-Caspase 3可以激活凋亡信號傳遞，促進細胞凋亡[22]。

按法作為推拿的代表手法之一，直接作用于人體體表，有調整臟腑、行氣活血的作用。研究表明，推拿可以降低外周阻力，提高心肌供氧，減輕心臟負荷，從而改善心臟心肌缺血缺氧狀態[23-24]。心俞穴是背俞穴之一，張介賓謂“十二之俞皆通于臟氣”，刺激背俞穴可以調節臟腑功能的盛衰，治療臟腑疾病。研究表明，背俞穴的分布規律與脊神經節段性分布特點大致吻合，提示背俞穴的治療作用與神經反應相關[25-27]。動物實驗發現，大鼠“心俞”對心肌缺血改善作用的神經生理學基礎與其對脊神經節區和腦PVN區的特異性反應相關。課題組前期研究已證實，按壓心俞穴可以調節心肌缺血損傷，但其作用機制需要進一步研究。

為了進一步驗證按壓心俞穴對心肌缺血的作用機制，以異丙腎上腺素誘導大鼠心肌缺血模型，研究其作用機制是否與細胞凋亡相關。本研究結果中，模型組心電圖中J點位移變化值>0.1 mv，血清cTn-Ⅰ、CK-MB水平顯著升高，提示心肌缺血模型大鼠造模成功；按法組心電圖J點位移變化值低于0.1 mv，血清cTn-Ⅰ、CK-MB含量明顯下降。HE染色切片可以形象直觀地觀察組織形態學改變，結果表明，模型組有大量膠原纖維存在，心肌細胞變性、壞死，而按法組心肌損傷程度明顯減輕。心肌缺血缺氧損傷后Bax蛋白和基因表達水平增加，Bcl-2蛋白表達降低，經治療后Bcl-2蛋白表達上調，而C-Caspase 3蛋白表達水平降低，減少細胞凋亡。本次實驗結果表明，模型組大鼠心肌組織中 C-Caspase 3、Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達下降，促進心肌細胞凋亡，按法干預后C-Caspase 3、Bax蛋白表達下調，Bcl-2蛋白表達上調，抑制心肌細胞凋亡，提示按法通過調節C-Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平調節心肌細胞凋亡，改善心肌缺血損傷。

綜上所述，按壓心俞穴對心肌缺血具有一定的治療作用，其作用機制與按法參與調節細胞凋亡密切相關，本研究為今后臨床上防治心肌缺血及其相關疾病提供一種新的治療方案。