基于網絡藥理學探討枳術丸異病同治功能性便秘和功能性消化不良的作用機制*

周蓉，黃柳向

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410000

功能性便秘(functional constipation，FC)和功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)均是臨床上常見的功能性疾病。FC是指排除藥物及器質性等因素，表現為糞質干硬、排便不盡感、排便費力等，每周自主排便少于3次的一種功能性腸病[1]，其病因可能與生活飲食習慣、腸道菌群失調、生理性括約肌障礙、精神心理等因素有關[2]。促動力藥、促分泌劑、瀉藥、膳食纖維制劑和中成藥等治療是FC的主要治療手段，生物反饋治療、改善心理狀態有助于提高治療效果[3]。近年來，腸道微生態調節對FC的效果明顯，說明腸道微生態紊亂可能是FC發病的關鍵因素[4]。FD是一種主要表現為腹部脹滿、疼痛、早飽、餐后飽脹，常伴有食欲減退、噯氣、惡心嘔吐等不適，并需排除器質性運輸影響的疾病[5]，發病機制復雜，包括幽門螺旋桿菌感染、胃腸道功能障礙、內臟高敏感性[6]，治療方法主要為H2受體拮抗劑、質子泵抑制劑、促動力藥物、消化酶制劑、精神心理治療及適當Hp根除治療[7]。

FC中醫屬于“便秘”，病位看似在大腸，實則在脾、胃，并與肝關系密切[8]。邱健行認為FC多因寒熱外邪、飲食不節、年老體衰引起，病機為氣血陰陽虧虛、冷熱積滯等[9]。FD中醫可歸屬于“痞滿”，病因包括感受外邪、情志失調、飲食不節、稟賦不足和勞倦過度等，基本病機為脾虛氣滯，其病位在胃，與肝脾密切相關[10]。FC和FD均為典型的慢性功能性胃腸道疾病，其病因相似，與脾胃關系密切，兩者往往伴隨出現，兼有腹痛、腹脹等不適[11]。枳術丸是由白術和枳實(21)兩味藥組成的經典方劑，方中白術健脾燥濕，助脾胃之運化；枳實破氣消積除痞，二者配伍，一補一消，白術的用量是枳實2倍，補重于消，以健脾為主，兼以理氣，共奏理氣和胃、消痞除滿之功[12]?，F代藥理實驗及臨床研究均表明，枳術丸治療消化系統疾病有確切的療效，體現了該方“異病同治”的特點[13-17]。

中藥復方治療FC和FD療效好、安全性高，且具有多靶點、多層次的作用機制。網絡藥理學可以使藥物與疾病之間的聯系具有整體性、系統性，對發現藥物靶點、指導新藥研發、揭示中藥復方的科學內涵、傳承和發展中醫藥理論均具有一定的指導性[18]。本研究基于網絡藥理學探討枳術丸對FC和FD“異病同治”的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 枳術丸活性成分及靶點的獲取本研究通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索白術和枳實的化學成分，并根據人體口服藥物的生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18對白術和枳實的化學成分進行篩選，采用TCMSP數據庫檢索活性成分的相關靶點，然后利用UniProt數據庫對篩選出的相關作用靶點蛋白名稱進行規范化。將篩選后的藥物活性成分與相關靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物活性成分-靶點”網絡圖。

1.2 疾病靶點獲取以“functional constipation”和“functional dyspepsia”為關鍵詞，選擇參數“Relevance score”大于其中位數，在Gene Cards疾病數據庫分別篩選出FC及FD的相關疾病靶點。

1.3 枳術丸活性成分相關靶點及FC、FD交集靶點的搜集使用微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)在線作圖平臺，分別輸入枳術丸活性成分靶點與FC和FD的疾病靶點，得到枳術丸治療FC及FD的潛在靶點和韋恩圖，以展示其交互作用關系。

1.4 潛在靶點的蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡構建在STRING數據庫(https：//string-db.org)導入潛在靶點，設定物種為人類“Homo sapiens”，蛋白相互關系置信度≥0.4，利用Cytoscape3.7.2軟件，使用“Network Analyze”得出其PPI網絡圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析為深入研究枳術丸對FC和FD“異病同治”的作用途徑及機制，將枳術丸治療FC、FD的潛在靶點導入Metascape數據庫(http：//metascape.org)，設定參數為H species且P<0.01，進行GO富集分析和KEGG富集分析，并使用微生信平臺繪制出GO簇狀條形圖與KEGG氣泡圖。

2 結果

2.1 枳術丸活性成分及其靶點通過TCMSP數據庫共搜集到枳術丸的活性成分120種，其中白術55種，枳實65種，篩選后共得到活性化學成分29種，其中白術7種，枳實22種，見表1。基于TCMSP獲得活性成分相關靶點329個，其中白術23個，枳實306個，借助UniProt數據庫標準化并去重后得到126個靶點。將藥物活性成分及其相關靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“藥物活性成分-靶點”網絡圖，見圖1。

表1 枳術丸藥物活性成分

圖1 “藥物活性成分-靶點”網絡圖

2.2 FC、FD疾病靶點以“functional constipation”和“functional dyspepsia”為關鍵詞通過Gene Cards疾病數據庫搜索FC靶點2 597個、FD靶點2 523個，選擇參數“Relevance score”大于其中位數，篩選出FC和FD的潛在靶點分別有1 299個和1 263個。

2.3 枳術丸治療FC、FD的潛在靶點在微生信在線作圖平臺中將FC和FD疾病的靶點及枳術丸藥物活性成分靶點進行映射，最終得到枳術丸與FC的交集靶點70個，枳術丸與FD的交集靶點81個，枳術丸、FC及FD三者交集靶點63個，這些靶點可能是枳術丸治療FC和FD的潛在靶點，導出得到的Venn圖。見圖2。

圖2 枳術丸、FC、FD交集靶點Venn圖

2.4 潛在靶點的PPI網絡在STRING數據庫中導入63個潛在靶點，并在Cytoscape 3.7.2軟件中利用“Network Analyze”作出PPI網絡圖，見圖3，圖中共63個節點，1 784條邊，其中節點表示蛋白，邊表示蛋白之間相互作用關系，顏色越深、節點越大則度值越大，表明該靶點關聯的靶點越多、作用越關鍵。根據度值(degree)排序，并以度值大于中位數(32)為條件篩選出核心靶點蛋白32個，這32個靶點蛋白可能是枳術丸治療FC和FD的關鍵靶蛋白，見表2。

表2 核心靶點蛋白信息

圖3 枳術丸治療FC、FD的潛在靶點PPI網絡圖

2.5 GO富集分析通過Metascape數據庫，對枳術丸治療FC和FD的63個潛在靶點進行GO富集分析，設定P<0.01，共得到生物學過程(biological process，BP)1 262個、分子功能(molecular function，MF)98個和細胞學組分(cellular components，CC)62個。BP主要包括對激素的反應(response to hormone)、對氧化應激的反應(response to oxidative stress)、對脂質的反應(cellular response to lipid)、對肽的反應(response to peptide)、對炎癥調節的反應(regulation of inflammatory response)等；MF包括磷酸酶結合(phosphatase binding)、信號傳導受體調節活性(signaling receptor regulator activity)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、激酶結合(kinase binding)、蛋白質同源二聚化活性(protein homodimerization activity)等；CC主要包括核包膜(nuclear envelope)、膜筏(membrane raft)、受體復合物(receptor complex)、轉錄調節劑復合物(transcription regulator complex)、內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)等。根據參數Count進行排序，對BP、MF、CC排名前10位的條目用簇狀條形圖表示，見圖4。

圖4 潛在靶點GO富集分析條形圖

2.6 KEGG富集分析結果KEGG富集分析共得到173條通路，根據P值將KEGG富集分析結果排序，將排名前20位通路作氣泡圖，見圖5。枳術丸治療FC和FD的潛在靶點參與的關鍵通路有癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、CLR信號通路、TCR信號通路、細胞凋亡、鞘脂類信號通路、IL-17信號通路、Th17細胞分化等，表明枳術丸可通過不同的信號通路協調發揮對FC和FD的“異病同治”作用。

圖5 潛在靶點KEGG信號通路富集分析氣泡圖

3 討論

FC和FD是消化系統兩種常見的功能性胃腸病，隨著生活習慣和飲食結構等的改變，二者發病率逐年升高，嚴重影響患者的生活質量，中醫藥在治療功能性疾病中具有一定的優勢[19-20]。異病同治是指不同疾病發生發展過程中出現了相同的病機，便可以采用相同的治療方法來治療，異病同治是辨證論治的具體體現[21]。枳術丸對FC和FD異病同治作用的本質即在于辨證論治，FC和FD均為典型的慢性功能性胃腸道疾病，病因相似，且均與脾胃關系密切，而枳術丸臨床上常用于治療脾虛證[17，22]。文獻研究發現，枳術丸臨床治療的優勢病種包括FC、FD、IBS等，且多用于脾胃虛弱和脾虛氣滯之證[23]。研究發現，在慢傳輸型便秘中，磷脂酶C-γ(PLC-γ)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的表達水平升高[22-24]，表明枳術丸可有效促進脾虛證慢傳輸型便秘腸道運動。研究發現，在FD大鼠中，枳術丸可促進胃腸道排空，減輕胃腸道敏感性，可能與5-羥色胺受體(5-HT receptor，5-HTR)和胃促生長素含量升高、降鈣素基因相關肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)含量降低有關[25]。

本研究設置參數OB≥30%、DL≥0.18獲得枳術丸活性成分29個，白術的主要化學成分包括揮發油類、多糖類、內酯類等，具有抗腫瘤、抗炎、調節消化系統的作用，常用于胃腸道疾病的治療[26]。枳實的主要有效成分為黃酮類、揮發油類及生物堿類化合物，其具有胃腸道調節作用及抗癌、抗氧化、促進脂質代謝、抗菌、抗炎等作用[27]。本研究通過PPI網絡拓撲分析共得出32個關鍵靶點，排名前10位的基因包括AKT1、TNF、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、EGFR等。AKT1與血管生成有關，可抑制細胞的凋亡、增殖、轉移等過程，促進細胞增殖和細胞存活[28]。在機體炎癥反應和免疫調節中，TNF和IL-6起著重要作用，在功能性消化不良患者中血清IL-6和TNF-α水平會升高[29]。TP53與炎癥相關，可使損傷的細胞發生凋亡，而在胃腸道中可保持黏膜的完整性[30]。VEGFA具有抗抑郁效應[31]，抑郁小鼠體內VEGF表達水平明顯降低[32]。MAPK3與應激、炎癥反應密切相關，可增加腸道水分、促進腸道蠕動，恢復慢傳輸型便秘大鼠的腸道功能[33]。EGFR與腸道結構和功能密切相關，具有促進消化吸收、影響酶活性、修復受損腸道組織和促進腸道發育等作用[34]。PPARG可減少炎癥因子的表達、抑制炎癥反應，腸道感染會影響PPARγ的表達及活性[35]。前列腺素內過氧化物合酶2是一種誘導型環氧合酶，在FD中，可促進炎性反應并能損傷部分組織，與慢性炎癥密切相關[36]。枳術丸通過以上核心靶點通過不同途徑調控炎癥因子并參與細胞增殖、分化、凋亡等，減少對黏膜、血管的損傷，從多個途徑干預FC和FD。

GO富集分析與KEGG富集分析表明，枳術丸通過調控體內多種信號通路對FC、FD發揮共同治療作用。枳術丸“異病同治”FC和FD主要通過參與調節癌癥通路、細胞凋亡、TNF信號通路、TCR信號通路、CLR信號通路、AGE-RAGE信號通路、鞘脂類信號通路、Th17細胞分化及IL-17信號通路等途徑發揮調控作用。AGE-RAGE信號通路可以激活并促進炎癥反應和氧化應激，兩者相互作用，可引起二酰甘油增多，使肝臟、骨骼肌處于高血糖環境，導致糖尿病及其并發癥的發生[37]，而FC和FD是糖尿病常見的慢性并發癥，其中功能性便秘的發生率占25%[38]。Th17細胞是CD4+T細胞的一組亞型，IL-17在多種炎癥性疾病中發揮重要作用，主要通過募集和激活中性粒細胞、誘導T細胞及巨噬細胞產生多種促炎因子從而引起炎癥的發生[39-40]。TNF-α是TNF家族中的主要因子，是一種促炎細胞因子，與機體免疫和細胞凋亡關系密切，TNF信號通路改變會增加消化系統炎癥的發病風險[41-42]。本研究表明，枳術丸對FC和FD的“異病同治”作用主要是通過減少細胞炎癥、激活機體免疫、抑制細胞凋亡等途徑而發揮的。

綜上所述，枳術丸對FC和FD的異病同治作用機制是多成分、多靶點、多途徑的，基于網絡藥理學探討其干預FC和FD的作用機制發現，其主要通過減少炎癥反應、激活機體免疫、抑制細胞凋亡，減少胃腸黏膜損傷，改善癥狀，為今后進一步實驗研究及臨床運用奠定了基礎。