固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素含量及其分布狀況

蔡 琛，程先先，吳學森

(1蚌埠醫學院公共衛生學院,安徽蚌埠 233000；2蚌埠市疾病預防控制中心，安徽蚌埠 233000)

交鏈孢霉在自然界中分布范圍極其廣泛，對一些植物不僅具有腐生性，還具有致病性[1]。低溫條件下交鏈孢霉菌能夠正常生長繁殖，因此在冷鏈儲藏和運輸過程中食品也會存在腐敗和變質[2]。該菌能產生多種有毒代謝產物，對人畜具有致癌作用并影響人畜健康。有研究表明，攝入被交鏈孢毒素污染的食品可能造成我國某些地區食管癌高發[3]。因此，食品中交鏈孢毒素的污染情況已成為重要的危害人體健康的公共衛生問題。橄欖油含有較高水平的單不飽和脂肪酸，研究表明，食用單不飽和脂肪酸有降低血糖[4]、調節血脂[5]、降低膽固醇[6]等功效，越來越多居民選擇橄欖油。2019—2020年，我國已成為橄欖油進口量增長的第二大市場，我國將成為未來世界第一大橄欖油消費國[7]。本研究就固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素含量及其分布狀況進行分析。

1 食品污染中最常見的交鏈孢毒素

污染食品的交鏈孢霉種類多種多樣，其產生的交鏈孢毒素主要包括交鏈孢菌酮酸(TeA) 、交鏈孢酚(AOH)、騰毒素(TEN)、交鏈孢酚單甲醚(AME) 4類毒素[8]。

2 交鏈孢毒素的毒性

大多數交鏈孢毒素對人體造成的急性毒性程度較低。但有研究表明，AOH、AME對細胞產生遺傳毒性[9]和導致細胞突變[10]。FehR等[11]研究認為，AOH和AME在微摩爾濃度下顯著增加了人類癌細胞(HT29,A431)的DNA鏈斷裂率，其中AOH有效地抑制了DNA的松弛，并刺激了拓撲異構酶I、IIα和IIβ的DNA裂解活性從而引起細胞 DNA損傷。YEKELER等[12]研究認為，AME和TeA對小鼠食道可能產生毒性影響。實驗表明，每天給小鼠喂食AME或TeA，持續10個月后，通過光鏡檢查，在TeA處理的動物中觀察到中度和嚴重的發育不良，其特征是極性喪失、核多形性和超色性，表現為食管粘膜出現癌前病變。Lehmann等[13]用AOH 處理V79細胞，發現細胞分裂周期停滯在G2和S期。Wollenhaupt等[14]研究發現，AOH對豬子宮內膜細胞的生存能力有影響。在用 AOH處理后，S期的細胞明顯減少，而G(0)/G(1)期的細胞停滯，因此認為AOH在翻譯水平上影響基因的表達。Liu等[15]發現，AME和AOH可與從人胎兒食道上皮細胞中分離出的DNA結合，激活其中的致癌物質c-H-ras和c-mys，并在體外促進人胎兒食道上皮細胞的增殖，其次在食道癌高發區林縣的糧食中分離出來的主要污染性真菌為AOH和AME，因此認為進食被交鏈孢毒素污染的食品可能與中國某些地區食管癌高發有關。

3 材料與方法

3.1 材料與試劑

3.1.1 材料 包裝橄欖油，市場購買。

3.1.2 試劑 細交鏈格孢菌酮酸(TeA，純度>99%)、鏈格孢酚(AOH，純度>99%)、騰毒素(TEN，純度>99%)和交鏈格孢酚單甲醚(AME，純度>99%)標準品，均購于美國 ROMER 公司；同位素內標：細交鏈格孢菌酮酸-D13(TeA-D13，純度>99%)、鏈格孢酚-D2(AOH-D2，純度>99%)、騰毒素-D3(TEN-D3，純度>99%)、交鏈格孢酚單甲醚-D3(AME-D3，純度>99%)、標準品，均購于加拿大 TRC 公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，購于美國Thermor Fisher公司；無水磷酸二氫鈉(色譜純)，購于天津科密歐化學試劑有限公司；碳酸氫銨(色譜純)，上海羅恩化學試劑有限公司；磷酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)：稱取6.0 g無水磷酸二氫鈉，溶解于950 mL水中，用磷酸調節pH 3.0，用水定容至1 000 mL，混勻；固相萃取柱(Waters Oasis HLB 200 mg/6cc)；樣品提取液：取550 mL乙腈，加到450 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)中，混勻；水(符合GB/T 6682規定的一級水)。

3.2 儀器與設備

Thermo Fisher 超高效液相色譜-串聯質譜儀，美國ThermoFisher公司，配有Hypersil Gold VANQUISH C18色譜柱(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)；超聲波清洗器，上海科器儀器設備有限公司；多管渦旋混勻儀，上海凈信實業發展有限公司；離心機，美國ThermoFisher公司；1/千電子天平，瑞士Mettle公司；50 mL塑料離心管，浙江拱東醫療器械股份有限公司；Milli-QA10 超純水器，美國 Millipore公司；固相萃取儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；氮吹儀，上海喬躍電子有限公司；移液器(1～10、10～100、100～1 000 μL)，德國eppendorf公司。

3.3 方法

3.3.1 超高效液相色譜條件 色譜柱型號：Hypersil Gold VANQUISH C18液相色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫條件：40℃；流動相配比：A(1.0 mmol/L碳酸氫銨溶液)+B(甲醇)，采用梯度洗脫；梯度洗脫程序見表1；進樣量：2 μL；流速：0.25 mL/min。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序

3.3.2 超高效液相色譜-串聯質譜條件 離子化模式：采用電噴霧離子源(ESI)；電離方式：負離子模式；質譜掃描方式：多反應監測(MRM)；電離電壓：3 500V；離子源溫度：350℃；鞘氣流量：35 Arb；碰撞氣流量：10 Arb；反吹氣流量：1 Arb。4種鏈格孢霉毒素及同位素內標物的保留時間、監測離子、錐孔電壓和碰撞電壓質譜參數如表2所示。

表2 4種交鏈孢霉菌毒素的質譜參數

3.3.3 標準溶液的配制 (1)同位素內標儲備液：分別準確稱取4種交鏈孢霉毒素內標標準品，用乙腈溶解并定容，混勻，得到TeA-D13儲備液(100 μg/mL)、AOH-D2儲備液(100 μg/mL)、TEN-D3儲備液(100 μg/mL)、AME-D3儲備液(100 μg/mL)，密封后置于-20℃避光保存。(2)標準儲備液：分別準確稱取適量4種鏈格孢霉毒素標準品，用甲醇溶解并定容，混勻，得到TeA標準儲備液(100 μg/mL)、AOH標準儲備液(100μg/mL)、TEN標準儲備液(100 μg/mL)、AME標準儲備液(100 μg/mL)，密封后置于-20℃避光保存。(3)混合標準工作液(TeA：500 ng/mL，AOH：200 ng/mL，TEN：100 ng/mL，AME：20 ng/mL)：分別準確移取50 μLTeA標準儲備液(100 μg/mL)、20 μLAOH儲備液(100 μg/mL)、10 μLTEN儲備液(100 μg/mL)、2 μLAME儲備液(100 μg/mL)至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，密封后置于4℃避光保存。(4)混合內標工作液(TeA-D13：500 ng/mL，AOH-D2：200 ng/mL，TEN：100 ng/mL，AME：20 ng/mL)：分別準確移取50 μLTeA-D13標準儲備液(100 μg/mL)、20 μLAOH-D2儲備液(100 μg/mL)、10 μLTEN-D3儲備液(100 μg/mL)、2 μLAME-D3儲備液(100 μg/mL)至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，密封后置于-20℃避光保存。(5)標準曲線繪制：取適量混合標準工作液和混合內標工作液，用甲醇和水配置成標準系列，具體配置信息見下表3。將標準系列溶液注入超高效液相色譜串聯質譜儀，得到4種交鏈孢霉菌毒素的色譜圖和峰面積。分別以TeA、AOH、TEN、AME的濃度為橫坐標，以TeA、AOH、TEN、AME的峰面積與各自內標峰面積之比為縱坐標，繪制TeA、AOH、TEN、AME標準曲線圖。

表3 4種交鏈孢霉菌毒素標準系列的配置方法

3.3.4 樣品前處理方法 (1)提取：橄欖油置于常溫避光保存，稱樣前需充分混勻。然后稱取橄欖油5 g(精確至0.001 g)于50 mL刻度離心管中，加入100 μL混合內標工作液，渦旋混勻10 s，靜置過夜。樣品中加入25 mL樣品提取液，旋緊蓋子，渦旋混勻10 s，高速渦旋振蕩器震蕩提取20 min，于4℃，10 000 r/min離心10 min，室溫靜置2 h，待溶液明顯分層且上清液無細小油粒后，移取5 mL上清液，加入15 mL 0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)，混勻，10 000 r/min離心10 min，上清液待凈化。(2)凈化：HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化。將稀釋后的上清液(20 mL)全部過柱，再用5 mL 20%甲醇溶液淋洗，于負壓狀態下抽干柱子5 min。將小試管放于固相萃取柱下，依次用5 mL甲醇和5 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于小試管中，45℃水浴氮吹近干，殘渣先用200 μL甲醇復溶，渦旋混勻10 s，再加1.8 mL水，渦旋混勻10 s。4℃，10 000 r/min下離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液經LC-MS/MS進行檢測。

4 結果與分析

4.1 線性關系和檢出限

在優化的高效液相色譜、質譜和前處理條件下對空白基質的標準系列進行檢測。表4結果表明，4種交鏈孢霉毒素在一定濃度范圍內均具有良好的線性關系，R>0.99。在信噪比為3 時，TeA 、AOH 、TEN、AME的檢出限在0.20～2.00 μg/kg 范圍之間。

表4 4種交鏈孢霉菌毒素的線性范圍、線性方程、R、檢出限

4.2 加標回收率

30份樣本中隨機選擇3份樣本，分別取其平行樣，在每份樣本平行樣中分別加入50 ngTeA、20 ngAOH、10 ngTEN、2 ngAME，與該樣本進行相同處理后經超高效液相色譜串聯質譜儀測定，計算得出回收率范圍92.25%～124.66%，精密度范圍3.79%～10.58%(表5)。

表5 4種交鏈孢霉菌毒素的加標回收率

4.3 橄欖油中4種交鏈孢霉菌毒素污染水平含量分析

本次橄欖油樣本量30份，每份樣本平行檢測6次取平均值。4種交鏈孢霉菌毒素在30份橄欖油中有不同濃度水平的檢出，總檢出率93.33%，總含量范圍0.631～4.261 μg/kg。AME檢出率最高93.33%，含量范圍0.631～9.098，最大濃度9.722 μg/kg，平均濃度2.361 μg/kg；AOH檢出率20.00%，含量范圍2.760～4.261，最大濃度4.261 μg/kg，平均濃度3.351 μg/kg；TEN檢出率10.00%，含量范圍0.705～1.288，最大濃度1.288 μg/kg，平均濃度0.959 μg/kg；TeA在30份樣本中未檢出，檢出率0.00%(表6)。

表6 4種交鏈孢霉菌毒素檢出率、含量范圍、最大濃度、平均濃度

4.4 橄欖油中4種交鏈孢霉菌毒素疊加檢出分析

30份橄欖油樣本中1種交鏈孢霉菌毒素檢出率93.33%，其中AOH檢出率20.00%、TEN檢出率10.00%、AME檢出率93.33%；2種交鏈孢霉菌毒素同時檢出率30.00%，其中TEN+AME同時檢出率10.00%、AOH+AME同時檢出率20.00%；3種交鏈孢霉菌毒素AOH+TEN+AME同時檢出率3.33%(表7)。

表7 交鏈孢霉菌毒素疊加檢出個數、檢出率

4.5 國產和進口橄欖油中4種交鏈孢霉菌毒素檢出分析

5份國產橄欖油中均檢測出交鏈孢霉菌毒素，檢出率100.00%。25份進口橄欖油中檢測出23份含有交鏈孢霉菌毒素，檢出率92.00%(表8)。但在5份國產橄欖油中交鏈孢霉菌毒素檢出成分均為AME，其他3種交鏈孢霉菌毒素均未檢出。25份進口橄欖油中AOH檢出6份，檢出率24.00%；TEN檢出3份，檢出率12.00%；AME檢出23份，檢出率92.00%(表9)。

表8 不同產地交鏈孢霉菌毒素檢出率

表9 不同產地4種交鏈孢霉菌毒素檢出率

5 結論與討論

建立固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定橄欖油中4種交鏈孢霉毒素的分析方法。本方法樣本檢測量小、靈敏度高、準確度高、精密度高，重現性好，是檢測橄欖油中交鏈孢霉毒素的理想方法。對采集的30份橄欖油進行檢測，結果發現，93.33%(28/30)的樣品至少受到1種交鏈孢霉毒素污染。橄欖油中4種交鏈孢霉毒素檢出率AME>AOH>TEN>TeA，AME毒素是橄欖油中最主要的檢出毒素。在交鏈孢霉菌毒素疊加檢出率分析中發現30.00%(9/30)的樣品受到2種及2種以上交鏈孢霉菌毒素污染。國產和進口橄欖油中分析發現，國產橄欖油中交鏈孢霉菌毒素檢出成分均為AME，進口橄欖油檢出成分有AOH、TEN、AME。

本研究僅測定包裝橄欖油中4種交鏈孢霉毒素，有文獻顯示[16]，糧油作物在入庫儲存前若水分未降至安全水分界限(≤14%) 則易發生霉變產生交鏈孢霉毒素。橄欖油中交鏈孢霉毒素的檢出，不確定是橄欖中本身含有還是儲存過程中產生，又或者壓榨工藝中存在污染，還需要進一步探討。目前交鏈孢霉毒素種類繁多，在食物中污染范圍較廣，尤其是存在于小麥、玉米等農作物及其制品中[17-18]，其對人體健康的危害性尚沒有引起廣泛的關注。Lattanzio等[19]對97份意大利谷物、番茄和葵花籽樣本中均檢出TeA、AOH、TENA、ME，其中，TeA污染水平最高為16 752 μg/kg，TEN污染水平最高為570 μg/kg。李磊等[20]研究發現，20份菜籽油中，2份樣品檢出TeA，3份樣品檢出AOH，本次研究填補了固相萃取-同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法測定橄欖油中交鏈孢霉毒素的空白。由于我國目前尚未對食品中交鏈孢霉毒素的檢出方法、限量標準進行規定，本次研究為將來交鏈孢霉毒素的風險評估和標準制定提供技術支持，從而更好地保護消費者健康。