miR-944在HPV16陽性宮頸癌患者組織表達及臨床意義

郭 鳳，黃 偉，王佩紅，趙 莉

(漢中市中心醫院1.婦科；2.神經外科，陜西 漢中 723000)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，僅在美國，每年就有大約13 000例新診斷宮頸癌[1]。中國宮頸癌的發病率遠高于美國或其他發達國家，并且很多婦女初次診斷就已是宮頸癌晚期，嚴重影響患者的治療效果及預后[2]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16、HPV18感染是宮頸癌發生的主要原因之一[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類20～22nt、非編碼的RNA，其通過完全或不完全堿基互補結合靶基因mRNA 的3′非編碼區(3′ UTR)，從轉錄水平或轉錄后水平調控靶基因表達，進而影響各項生命活動[4]。研究表明，miRNA可以作為致癌或腫瘤抑制因子廣泛調節宮頸癌細胞的增殖、遷移或凋亡[5]。但是miRNA與高危型HPV相關宮頸癌的相互作用還需進一步的探討；本研究旨在探索miR-944在HPV16陽性宮頸癌患者組織中的表達情況，及其對于宮頸癌的早期診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年12月在漢中市中心醫院就診的宮頸癌患者113例作為實驗組，其中HPV16陽性70例，HPV 16陰性43例；并將同期在我院進行良性腫瘤切除術的78例患者作為對照組。兩組患者年齡、分娩史、絕經比例等差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

實驗組納入標準：①術后病理診斷為宮頸癌；②術前檢測HPV16呈陽性或陰性；③病理資料完整；④術前未接受放化療且治療前半年內未服用激素類藥物。對照組納入標準：①術前診斷HPV16為陰性；②良性疾病行子宮切除患者，排除宮頸病變。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②嚴重心肝腎功能不全者；③患有嚴重感染性疾病患者。參加本研究的所有患者及家屬均簽署知情同意書；本研究已通過我院倫理委員會批準同意。

1.2 HE染色

宮頸癌患者接受根治性子宮切除術+盆腔淋巴結清掃術獲取腫瘤組織和癌旁組織；良性腫瘤患者行子宮全切術或宮頸活檢。獲取組織后，即置于液氮或-80℃冰箱保存。組織經10%福爾馬林固定后，進行常規石蠟包埋并切片，切片厚度為4μm。石蠟切片經二甲苯脫蠟，并經無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和蒸餾水水化后，使用蘇木素染色5～10min，1%鹽酸乙醇分化5～10s，并使用1%氨水反藍，伊紅染色1～3min，脫水透明，干燥后加滴中性橡膠封固，鏡檢。

1.3 實時熒光定量PCR檢測miR-944組織表達情況

將組織標本采用液氮研磨，并采用TRIzol法提取組織總RNA，并通過Nanodrop 2000及瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的濃度和純度，A260/A280處于1.8～2.1時可進行后續實驗；取1μg總RNA反轉錄為cDNA；實時熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)檢測miR-944表達，嚴格按照SYBR Green PCR試劑盒操作。引物序列為：miR-944上游引物：5′-CGCGAGCAGGAAATTATTGTA-3′，下游引物：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′；內參為U6，上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，所有引物由上海生工合成。擴增程序為：95℃預變性5min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，進行40個循環，每個實驗設置5個復孔，反應結束后采用2-ΔΔCt計算miR-944的相對表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組患者病理切片對比

兩組患者的組織切片進行HE染色后，對照組未見上皮細胞惡性病變組織，宮頸組織上皮層均為分化成熟的上皮細胞，細胞胞漿豐富，且上皮層未見挖空細胞，無核分裂現象。實驗組宮頸癌組織顯示上皮大部分細胞異型性明顯，有挖空細胞，基底細胞非典型性，成熟結構紊亂，核分裂現象明顯，見圖1。

注：A.對照組；B.實驗組。

2.2 兩組患者miR-944表達差異

miR-944在實驗組HPV16陽性患者的相對表達量為2.55±0.34；在實驗組HPV16陰性患者中的相對表達量為1.88±0.43，在對照組中的相對表達量為1.38±0.41，miR-944表達在實驗組HPV16陽性患者、實驗組HPV16陰性患者及對照組之間差異有統計學意義(F=189.516，P<0.05)。兩兩比較顯示，實驗組患者miR-944的相對表達量明顯高于對照組(P<0.05)；實驗組中HPV16陽性患者 miR-944的相對表達量顯著高于HPV16陰性患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同患者miR-944的表達差異Fig.2 Differences in expression of miR-944 in different groups of patients

2.3 宮頸癌組織與癌旁組織miR-944表達差異

比較實驗組患者腫瘤組織與癌旁組織miR-944表達差異，結果見圖3。腫瘤組織miR-944的相對表達量為2.26±0.46，明顯高于癌旁組織的1.32±0.39，差異有統計學意義(t=17.392，P<0.05)。

圖3 宮頸癌患者腫瘤組織與癌旁組織miR-944的相對表達量Fig.3 Relative expressions of miR-944 in the cancer tissues and the adjacent tissues

2.4 ROC曲線評估miR-944對宮頸癌的診斷價值

ROC曲線評估miR-944對宮頸癌的診斷價值，結果見圖4。ROC曲線下面積AUC為0.855，95%CI為0.790～0.921，敏感度為71.40%，特異度為97.30%，Youden指數為0.688，截斷值為1.54。

圖4 miR-944對宮頸癌診斷的ROC曲線Fig.4 ROC curve of miR-944 for diagnosing cervical cancer

2.5 miR-944與宮頸癌患者臨床病理參數相關性

按照miR-944相對表達量的中位數(2.24)將實驗組又分為miR-944低表達組(n=55)和miR-944高表達組(n=58)。分析miR-944與實驗組患者臨床病理學參數的相關性，結果顯示miR-944與年齡、腫瘤大小無明顯關系(P>0.05)；與HPV16感染、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)，見表1。

表1 miR-944與宮頸癌患者臨床病理參數相關性[n(%)]Table 1 Correlations of miR-944 with clinicopathological parameters of the patients with cervical cancer [n(%)]

3 討論

3.1 HPV16陽性與宮頸癌發生的相關性

HPV與高級別宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌的發生密切相關，研究發現40%～80%的宮頸癌患者屬于單一HPV類型。HPV根據生物學特性分為高危型和低危型，其中高危型的E6和E7基因是宮頸癌發生的重要因子，E6通過泛素化水解途徑降解轉錄因子p53，E7可介導腫瘤抑制因子pRB的降解；進而促進宮頸癌的發生[6]。Tao等[7]人調查了上海人群所有類型宮頸癌細胞學標本中個體高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的患病率和致癌風險，發現HPV16/18在高級別的宮頸病變和鱗狀細胞癌細胞學中分別有53.6%和66.7%的表達，由此可見，HPV16在宮頸癌變中是最常見的HPV亞型，需要引起臨床工作者重視。

3.2 MiR-944在惡性腫瘤中的作用機制

MiRNAs參與調節多種生理活動，并且miRNAs在多種腫瘤組織中呈異常表達，作為調控基因影響腫瘤進展，也可作為癌癥的診斷和預后的預測標志物。已有多個研究表明miR-944在不同腫瘤的發生發展中有重要作用，Tang等[8]人在大腸癌患者的臨床試驗中發現miR-944可以作為腫瘤抑制因子而抑制大腸癌的發現，其發現大腸癌組織中，miR-944表達下調，并且miR-944表達與原發腫瘤、淋巴結轉移、遠端轉移及TNM(tumor node metastasis )分期、浸潤程度呈明顯負相關。雙熒光素酶報告子分析表明，miR-944在結構上與GATA結合蛋白6(GATA6)結合，并與CRC細胞中的下游蛋白(CRT和p-AKT)相互作用而抑制大腸癌細胞的生物學行為。Jiang等[9]人也發現膠質瘤干細胞(GSCs)外泌體miR-944通過抑制VEGFC的表達和AKT/ERK信號通路來抑制膠質瘤的生長、進展和血管生成。通過以上結果表明，miR-944在不同類型的腫瘤中發揮不同的作用。

3.3 MiR-944在宮頸癌中的研究進展

MiR-944在宮頸癌進展中的作用也有所研究，李新菊等[10]人發現miR-944在宮頸癌細胞和組織中表達升高，并且能通過靶向調控S100PBP基因促進宮頸癌細胞增殖和遷移。本研究也有相似的結果，與對照組相比，實驗組的宮頸癌組織miR-944表達顯著升高，并且HPV16陽性患者miR-944表達顯著高于HPV16陰性。采用ROC曲線評估miR-944的診斷價值，結果顯示AUC為0.855，95%CI為0.790～0.921，敏感度為71.4%，特異度為97.3%；miR-944與年齡、腫瘤大小無明顯關系(P>0.05)；與HPV16感染、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移明顯有關(P<0.05)。所以miR-944在宮頸癌的臨床診斷中有重要作用，并且與病理學參數關系密切，可為臨床醫生制定治療方案提供新思路。

綜上，miR-944在HPV16相關的宮頸癌組織中差異表達，并且對于宮頸癌的早期診斷具有重要價值，也可作為治療的潛在靶點；后期的研究中可通過體內體外實驗進一步探究其在宮頸癌發生發展中的分子機制。