針刺療法對AD大鼠的治療作用及其機制的實驗研究

陶晶 楊曉帆 趙志軒 李宏

1牡丹江醫學院附屬紅旗醫院高壓氧科，牡丹江 157000；2牡丹江醫學院附屬紅旗醫院康復科，牡丹江 157000；3 牡丹江醫學院附屬紅旗醫院中西醫結合科，牡丹江 157000；4牡丹江醫學院附屬紅旗醫院興平社區衛生服務中心，牡丹江 157000

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病［1］。據國際2018 年發布的數據，預計到2050 年AD 患者將高達1.52億［2］。由于現有藥物不能完全治愈AD，且不良反應較多［3］。因此，有必要去尋找新的突破性療法。現有研究表明，AD 的主要特征是形成細胞外淀粉樣斑塊和細胞內神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFT）。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，β-AP）是淀粉樣蛋白斑塊的主要成分，β-AP升高與認知缺陷的嚴重程度有關［4］。tau 是存在于大腦中最高水平的微管相關蛋白，它為細胞骨架微管提供穩定性，重要的是，神經元中磷酸化tau的聚集阻斷了神經元轉運系統，并在NFT的形成中起關鍵作用。此外，磷酸化tau水平也與認知障礙的行為異常密切相關［5］。因此，在本研究中，檢測了β-AP 和磷酸化tau 的水平。針灸是一種非藥物的傳統中醫療法，已有2 000多年的歷史。大量臨床研究顯示，針灸可有效改善患者的認知功能，而且沒有明顯不良反應。近年來，越來越多的動物實驗被用來探索針灸治療神經退行性疾病的機制［6-7］。本研究旨在確定針刺療法是否可通過調節海馬中β-AP 和磷酸化tau的水平來改善學習和記憶能力，以期為未來針灸的臨床應用提供實驗和理論依據。

材料與方法

1.實驗材料

1.1.動物與分組 本研究為動物實驗。SPF 級體質量為240～270 g 的Wistar 雄性大鼠（合格證號02-24-4），購自黑龍江中醫藥大學，許可證號：SYXK（黑）2021-010。實驗前大鼠適應1周，在（20±2）℃和（50±10）%的相對濕度，12 h 的光照/黑暗循環（早上8：00 開燈）環境下飼養所有大鼠（每籠5 只），自由進食和水。使用隨機數字表法將大鼠分為以下4 組（每組5 只）：對照（A）組、模型（B）組、針刺（C）組、藥物治療對照（D）組。所有動物程序均于2017 年10 月10日經牡丹江醫學院附屬紅旗醫院動物倫理委員會的批準（NO.20-0509）。

1.2.主要藥品與試劑 D-半乳糖（D-galactose，D-gal，V900922，純度≥98%）獲自美國Sigma；三氯化鋁（AlCl3，7784-13-6，純度≥99%），氫溴酸東莨菪堿（scopolamine hydrobromine，SCOP，55-16-3，純度＞98%）獲自上海阿拉丁；哈伯因（HY-17387，純度≥98.0%）獲自美國MedChemExpress；β-AP（ab289991）、p-tau（s396，ab32057）和p-tau（s404，ab92676）均獲自英國Abcam；原位細胞凋亡檢測試劑盒（11684817910）購自瑞士Roche公司。

2.動物造模［8］

將適應生長1 周的大鼠經Y-迷宮測試剔除不合格大鼠。B組、C組和D組大鼠每天腹腔內注射D-gal（48 mg/kg）、每天喂飼AlCl3水溶液2 ml（20 mg/ml），在實驗觀察前10 min腹腔注射SCOP（2 mg/kg）。A 組大鼠常規飲水、進食，并以上述方式（喂飼和腹腔注射）給予等量的生理鹽水。6 周后經Y-迷宮測試檢驗模型是否構建成功。

3.治療方法

C 組大鼠用量身定制的軟布材料包裹，并在有意識的狀態下俯臥，而不是麻醉。從腹腔注射D-gal 的第1 天開始針刺。使用30 號0.5 寸毫針依照華興邦定穴法選取大鼠的腎俞、太溪、足三里、神門、百會穴5 個穴位并通過捻轉補法1 min。隨后，連接G6805 電針治療儀（上海涵飛醫療）以1 Hz的頻率刺激20 min（連續波），強度控制以大鼠肢體輕度抖動為度。每天1次，10 d為1個療程，治療3個療程。D 組自實驗開始之日起每只大鼠每天灌服哈伯因混懸液（17 μg/2 ml），療程與C 組相同。A 組和B 組大鼠常規飼養相同時間。治療結束后，觀察大鼠訓練及行為學指標。

4.方法

4.1.Y-迷宮測試［9］采用Y-迷宮實驗檢測大鼠的記憶缺陷，檢測4 組大鼠電擊后的逃避潛伏期和正確次數。Y-迷宮測試由3個相似的臂組成，它們都彼此呈120°放置，具有三角形的中心區域。當大鼠被放回設備中時，帶燈的一只手臂沒有電，剩下的兩只手臂帶電。大鼠被0.2 mA、500 ms、每1.5 s 的電流電擊一次。因此，為了避免被電擊，老鼠不得不從電臂競技場移動到沒有電的照明臂。迷宮上方的攝像機確定并記錄了大鼠從先前被阻塞的手臂移動到打開燈的非電動手臂所花費的逃生潛伏時間（逃避潛伏期）。大鼠在逃避潛伏期小于10 s時完成一次主動回避，記錄主動回避次數（正確次數）。

4.2.跳臺測試［10］跳臺實驗箱尺寸為25 cm×25 cm×75 cm，箱底用金屬網格覆蓋，在箱底一角放置一個高5 cm、直徑8 cm的安全平臺盒子。第1天，將大鼠放在安全平臺上。當老鼠跳下平臺時，它的四肢會受到電擊（3 Hz，0.4 mA），經過反復上下跳躍，老鼠最終會在平臺上停住300 s。第2 天重復同樣的實驗，對大鼠第一次跳出平臺的時間（潛伏期）進行統計，同時對大鼠在300 s內跳出平臺的次數（錯誤次數）進行統計。

4.3.莫里斯水迷宮測試［11］跳臺實驗后進行莫里斯水迷宮測試檢測大鼠的空間學習能力。莫里斯水迷宮是一個圓形不銹鋼水池，直徑150 cm，高60 cm，將游泳池劃分成4 個象限。逃生平臺是一個直徑10 cm 的透明圓柱形平臺。實驗分為兩部分：（1）定位航行實驗：將大鼠從4 個不同的象限置于水池中，逃避潛伏期為大鼠從進入水中爬上象限中心平臺的時間長度。（2）空間探索實驗：第6天，移走平臺，將大鼠從平臺所在象限對面的象限放回水池，對大鼠90 s 內在原平臺象限停留時間（對目標象限探索時間）和它們穿越平臺位置的數量（穿越平臺次數）進行統計。

4.4.尼氏體亞甲藍特殊染色 各組大鼠經行為學指標檢測后，麻醉大鼠，并通過腦灌注、固定，將大鼠從額極向后至枕極分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五等份，取含有海馬的Ⅱ腦片，經石蠟包埋后制備常規石蠟切片，通過Nissl 染色觀察各組大鼠海馬神經元損傷情況。

4.5.TUNEL 染色 根據制造商說明進行TUNEL 染色以檢測Ⅱ腦片神經元的凋亡情況。同時使用蘇木精對細胞核進行染色，棕色細胞占藍色細胞的比值為神經元凋亡率。

4.6.免疫組化檢測β-AP、tau 蛋白表達 將石蠟包埋的Ⅱ腦片切成5 μm 的切片，經過脫蠟、水化、抗原修復、內源酶滅活和封閉等一系列處理過程后，腦切片依次與一抗溶液和熒光偶聯二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精襯染，并用顯微鏡觀察，陽性細胞被染色為棕黃色。

5.統計分析

所有統計分析均使用SPSS 22.0，計量資料符合正態分布，以均數±標準差表示，使用單因素方差分析進行多組比較，然后選擇Tukey 檢驗進行多重比較。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

結果

1.針刺療法改善D-gal 聯合AlCl3引起的AD 大鼠認知功能障礙

由表1可見，Y-迷宮實驗顯示，與A組相比，B組大鼠逃避潛伏期較長，正確次數減少（均P＜0.05）；與B組相比，C組和D 組通過治療顯著縮短了大鼠逃避潛伏期，增加了正確次數（均P＜0.05）。跳臺實驗顯示，與A 組相比，B 組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，且錯誤次數增加（均P＜0.05）；與B 組相比，C 組和D 組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，錯誤次數顯著減少（均P＜0.05）。莫里斯水迷宮測試結果顯示，前5 d隨著訓練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期縮短，且與A 組相比，B 組模型大鼠逃避潛伏期延長，對目標象限探索時間和穿越平臺次數減少（均P＜0.05）；與B 組相比，C 組和D 組經治療后縮短了大鼠逃避潛伏期，同時增加了對目標標象限探索時間和穿越平臺次數（均P＜0.05）。以上數據顯示，針刺可緩解D-gal 聯合AlCl3引起的大鼠工作記憶和空間學習能力障礙，與哈伯因治療具有相類似的效果，表明針刺療法對改善認知功能具有一定的積極作用。

表1 針刺療法對D-gal聯合AlCl3誘導的大鼠認知功能障礙的影響（）

表1 針刺療法對D-gal聯合AlCl3誘導的大鼠認知功能障礙的影響（）

注：A組為對照組，B組為AD模型組，C組為針刺組，D組為藥物治療對照組；D-gal為D-半乳糖，AlCl3為三氯化鋁，AD為阿爾茲海默癥；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

2.針刺療法改善D-gal 聯合AlCl3引起的AD 大鼠神經元損傷

圖1、表2 結果顯示，A 組大鼠海馬CA1、CA3、DG 區神經元呈錐形，排列緊密；同時，尼氏體增多，細胞排列緊密，形態規則，胞質顏色較深。相反，B 組模型大鼠海馬尼氏體疏松、稀疏、形狀不規則，尼氏體數量明顯減少，表明D-gal聯合AlCl3誘導CA1、CA3 和DG 區神經元損傷。與B 組相比，C 組和D 組大鼠海馬錐體細胞恢復，并保持基本神經元的結構完整；同時CA1、CA3、DG 區尼氏體數量增多。對各組大鼠尼氏體數量統計得出，針刺治療后可顯著增高D-gal聯合AlCl3引起的尼氏體數量減少（均P＜0.05），且與哈伯因治療效果相似。總之，針刺療法顯示出了對AD大鼠的保護作用并逆轉了D-gal聯合AlCl3誘導的海馬神經元損傷。

圖1 尼氏體亞甲藍特殊染色檢測各組大鼠海馬神經元損傷情況（尼氏體呈現紫藍色 ×400）

表2 各組大鼠海馬組織中尼氏體數量定量分析（個，）

表2 各組大鼠海馬組織中尼氏體數量定量分析（個，）

注：A 組為對照組，B 組為阿爾茲海默癥（AD）模型組，C 組為針刺組，D 組為藥物治療對照組；與A 組比較，aP＜0.05；與B 組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

3.針刺療法抑制D-gal 聯合AlCl3引起的AD 大鼠海馬組織中神經元凋亡

A 組、B 組、C 組、D 組大鼠海馬組織中神經元凋亡率依次 為（3.15±0.21）%、（21.36±2.57）%、（13.21±1.25）%、（11.25±1.23）%；與A 組比較，B組大鼠海馬組織中神經元凋亡率升高（P＜0.05）；與B 組比較，C 組和D 組大鼠海馬組織中神經元凋亡率降低（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 TUNEL染色檢測各組大鼠神經元凋亡情況（棕色細胞表示凋亡的神經元 ×400）

4.針刺療法降低D-gal 聯合AlCl3引起的AD 大鼠海馬組織中β-AP和tau水平

圖3、表3 結果顯示，與A 組比較，B 組大鼠海馬組織中β-AP、p-tau（s396）和p-tau（s404）顯著升高（均P＜0.05）；與B組比較，C組和D組大鼠海馬組織中β-AP、p-tau（s396）和p-tau（s404）明顯降低（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠海馬組織中β-AP和tau水平統計（%，）

表3 各組大鼠海馬組織中β-AP和tau水平統計（%，）

注：A 組為對照組，B 組為AD 模型組，C 組為針刺組，D 組為藥物治療對照組；β-AP 為β-淀粉樣蛋白，AD 為阿爾茲海默癥；與A 組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

圖3 免疫組化檢測各組大鼠海馬組織中β-AP和tau水平（棕黃色細胞表示陽性細胞 ×400）

討論

雖然AD的病理改變發生在腦內，但中醫臟腑辨證認為其病根與腎功能不全有關。根據中醫理論，腦與腎密切相關，腎含精髓。此外，延髓還可以生成骨髓，促進腦功能［12］。因此，正常的大腦功能依賴于腎精，補腎化痰中藥對AD 有一定療效。據報道，電針百會、腎俞、太溪穴可抑制AD小鼠模型β-AP的形成［13］。研究表明，百會和足三里穴聯合使用可增強AD大鼠的治療效果［14］。此外，神門穴是手少陰心經的輸穴和原穴，主治癡呆［15］。據報道，腹腔注射D-gal 被廣泛用于衰老相關疾病的研究。研究證實，腹腔注射D-gal可誘導氧化損傷，通過升高丙二醛水平和降低超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性在短時間內引起亞急性衰老動物模型［16］。綜上，本研究采用腹腔注射D-gal 聯合AlCl3誘導AD 大鼠模型，依照華興邦定穴法選取大鼠的腎俞、太溪、足三里、神門和百會穴5 個穴位進行針刺治療，以探究針刺療法對AD大鼠的治療作用及其作用機制。

為了探究針刺是否可改善AD大鼠的學習記憶功能，采用Y-迷宮、跳臺和莫里斯水迷宮等一系列實驗檢測針刺治療對AD 大鼠行為變化的影響。據報道，Y-迷宮測試被廣泛應用于研究小鼠的學習記憶能力［9］；跳臺實驗則是操作簡單、可行性較大的一種學習記憶的實驗方案［10］；莫里斯水迷宮實驗是研究嚙齒動物海馬依賴的空間參考學習和記憶最可靠的方法之一［11］。本研究結果表明，AD 模型大鼠的記憶和學習功能障礙會導致行為表現異常，且神經元受損，神經元凋亡增加，這表明該模型是成功的。然而，在使用針刺治療后，3 種檢測方法中的逃避潛伏期均縮短，且神經元損傷與凋亡有所改善，表明針刺療法改善了大鼠的認知能力并改善了記憶缺陷。另外，哈伯因又稱石杉堿甲，數百年來一直在中國民間醫學中用于治療癡呆癥［17］。本研究結果顯示，針刺療法與藥物治療效果類似，表明針刺療法可用于臨床AD的治療，但是否將經典藥物治療與非藥物干預相結合具有更好的效果仍不清楚。此外，本結果還顯示針刺療法略弱于藥物治療效果，可能與藥物干預的劑量有關，也可能與藥物多靶點的特性有關，關于其具體的原因仍需要更深入探究。

β-AP 和磷酸化tau 是AD 的特征性病理產物和治療靶點，多年來一直在研究它們在認知障礙相關疾病中的作用。此外，已經證明β-AP 可以形成老年斑并導致神經元死亡，以及認知和記憶障礙［18］。磷酸化tau蛋白是參與AD機制的另一個重要因素。微管相關蛋白——tau 蛋白是細胞骨架的重要組成部分，也是確保微管系統完整性和穩定性的關鍵。所以磷酸化tau 蛋白水平升高會通過調控微管的穩定性促進NFT 形成，誘發AD［19］。目前，已在tau蛋白上鑒定出多種磷酸化位點，其中s396 和s404 被鑒定為參與調節微管與tau蛋白結合并與斑塊密切相關的關鍵位點［20］。因此，檢測海馬中β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的水平是評估AD 治療效果的關鍵。根據本研究結果，針刺療法可改善行為測試中的學習和空間記憶障礙，這種效果可能與海馬中β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的減少相關。但無論如何，以上結果都無法證明針刺療法是通過直接還是間接的方式導致了AD模型大鼠海馬區β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的變化，還有待進一步完善。

總之，這是一篇在AD模型中評估針刺腎俞、太溪、足三里、神門和百會穴5 個穴位的治療效果以及其對β-AP 和磷酸化tau 水平影響的文章。筆者發現，對腎俞、太溪、足三里、神門和百會穴5 個穴位的針刺治療顯著提高了AD 大鼠的學習以及記憶能力，并減輕了神經元損傷與凋亡，這可能是與通過降低β-AP和磷酸化tau水平的表達來實現的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突