外源性堿性成纖維細胞生長因子對大鼠陰莖肌源性干細胞增殖的影響

馮娟娟 王正位 張晨 劉媛媛 程廣舟 王磊

1濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院泌尿外科，滕州 277500；2濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院神經內科，滕州 277500

目前，干細胞技術在陰莖勃起功能障礙診治中的研究已成為熱點問題［1］。干細胞具有多潛能自我復制能力，能夠分泌組織細胞所需的細胞因子甚至分化為相應組織細胞，使得受損細胞恢復功能甚至再生［2］。其中，肌源性干細胞是一種具有增殖分化潛能的、未向任何方向定型的原始成體干細胞［3-5］，已初步應用于基因治療和組織工程等領域［6-7］，而且，Kovanecz等［3］已證實了陰莖海綿體中存在著內源性干細胞。正源于此，學者認為陰莖海綿體內源性干細胞有望為勃起功能障礙的治療開辟新途徑。但是，肌源性干細胞的相關研究仍存在諸多方面難題亟待解決，其中，肌源性干細胞在體外純化、擴增、定向分化等便是關鍵問題。目前，已有相關研究證實某些生物活性因子能夠作用于干細胞的增殖并產生促進增值的作用［8-9］，其中研究比較深入者便是堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），bFGF又稱作FGF-2，屬于FGF1亞家族，bFGF作為一種信號分泌蛋白幾乎在所有組織中都有表達［10］。bFGF 與細胞膜上的酪氨酸激酶成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）結合產生生物學活性，促進細胞黏附、增殖、分化，其在傷口愈合、損傷修復和組織再生中的相關報道較多［11-12］，而將其用于肌源性干細胞的增殖的相關研究報道較少［13-15］，為此，本課題以大鼠陰莖肌源性干細胞作為研究對象，進一步了探討了外源性bFGF對其體外增殖的作用效果，現報道如下。

材料與方法

1.一般資料

本試驗自2020 年12 月至2021 年6 月在滕州市中心人民醫院精準實驗室完成。選取健康雄性Wistar大鼠5只，體質量（200±50）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［使用許可證號：SYXK（魯）20180002，生產許可證號：SCXK（魯）20200003］。主要試劑與儀器：胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、Percoll分層液、DMEM/F12培養基、胎牛血清（上海源聚生物科技有限公司，中國）；Sca-1 及Desmin 免疫組化試劑盒（UCL 公司，美國）；外源性bFGF（珠海生物制品有新公司，中國）；CO2培養箱（上海醫療器械有限公司，中國）；奧林巴斯Ⅸ51熒光倒置顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司，日本）；SW-CJ-1FD超凈臺（蘇州江東精密儀器有限公司，中國）；四甲基偶氮唑藍（MTT）酶標儀（北京普朗新技術有限公司，中國）。

本試驗動物符合3R 原則，試驗通過濟寧醫學院附屬醫院醫學科學研究倫理委員會批準（2020B002）。

2.實驗方法

取大鼠陰莖海綿體組織消化、培養，通過密度梯度離心法進行純化［16］。細胞存活率≥95%時再進行下一步實驗。運用改良的Preplate 差速貼壁法［16］進行傳代培養。通過細胞玻片、PBS 漂洗細胞鋪片、細胞固定、水化、通透、加入滅活酶、一抗、二抗、封片逐步進行Sca-1、Desmin 的免疫熒光細胞化學鑒定，同步設定陰性對照。最后通過熒光顯微鏡觀察拍照，照片采用Image-Pro PLUS 5.0軟件進行處理。應用蘇木精-伊紅染色觀察肌源性干細胞的形態。

MTT比色實驗。加樣：取第2代肌源性干細胞，先用0.1%胰酶消化后，再用生長培養基重新懸浮，以1×106/ml 濃度、200 μl/孔接種于96孔板，設置5塊試驗板。A板為實驗組：分別加入終質量濃度為10 μg/L、30 μg/L、50 μg/L、70 μg/L、90 μg/L 外源性bFGF；B、C、D、E 板的實驗組生長因子終濃度均為90 μg/L。5 塊板均設立空白對照組（每孔加200 μl生長培養基）、陰性對照組（每孔加200 μl生長培養基+肌源性干細胞）。均放于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養。呈色：5板分別于培養24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h呈色。

3.統計學方法

通過SPSS 21.0 軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，實驗組與對照組比較采用獨立樣本t檢驗，多重比較采用Tukey 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

1.體外培養大鼠陰莖肌源性干細胞的形態觀察

剛分離的肌源性干細胞貼壁緩慢，少量細胞仍處于懸浮狀態，數量少且體積小，多呈球形，有一定折光性，綠色箭頭示貼壁的球形細胞，黃色箭頭示懸浮于培養液中的少量細胞，見圖1A；原代培養3 d后PP6中懸浮細胞消失，貼壁后的細胞特點：體積增大，可見細長梭形或紡錘形，見圖1B；培養4 d 時細胞特點：向對方伸出小的突起，呈網狀趨于融合，趨于平行排列，此時肌源性干細胞已融合形成多核肌管，并可見肌管收縮，見圖1C；培養4 d后，蘇木精-伊紅染色可見肌源性干細胞呈梭形平行排列，見圖1D。

圖1 體外培養大鼠陰莖肌源性干細胞的形態學觀察。A 為剛分離的肌源性干細胞（×100），綠色箭頭示貼壁的球形細胞，黃色箭頭示懸浮于培養液中的少量細胞；B 為原代培養3 d 后PP6 中貼壁后的肌源性干細胞（×100）；C 為培養4 d 時的肌源性干細胞（×100）；D 為培養4 d 后經蘇木精-伊紅染色的肌源性干細胞（×200）

2.肌源性干細胞的鑒定及流式細胞儀檢測

通過免疫細胞化學染色檢測PP6 及傳代培養細胞，肌源性干細胞標記物Sca-1、Desmin 的表達情況，熒光顯微鏡下見：PP6 及傳代細胞均能表達Sca-1、Desmin，且隨著代數的增加，免疫熒光陽性率無明顯降低，見圖2A；PP6 細胞流式細胞儀檢測，Sca-1 表達量為（79.90±1.82）%，見圖2B；少數呈Desmin 陽性反應，表達量為（68.60±0.72）%，其流式細胞檢測見圖2C。

圖2 大鼠陰莖肌源性干細胞的鑒定及流式細胞儀檢測。A為PP6及傳代培養細胞（×100）；B為肌源性干細胞中Sca-1檢測結果；C為肌源性干細胞中Desmin檢測結果

3.MTT比色實驗結果

在不同培養時間點，外源性bFGF對肌源性干細胞的促增殖效應不同，隨培養時間的延長，肌源性干細胞增殖逐漸加強。培養24 h、48 h與72 h，兩組肌源性干細胞數量均增多，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）；實驗組出現顯著促增殖效應的培養時間為96 h、120 h、144 h（均P＜0.01），且在此時間點，實驗組的增殖效應均明顯高于對照組（均P＜0.01）；但培養96 h 之后兩組增殖效應均不再繼續增加，反而呈下降趨勢。見圖3。

圖3 不同培養時間點大鼠陰莖肌源性干細胞的生長曲線示意圖

4.不同終濃度的外源性bFGF 對肌源性干細胞的促增殖效應

培養96 h 時MTT 法檢測兩組肌源性干細胞增殖效應，發現不同終濃度的外源性bFGF 對肌源性干細胞的促增殖效應也不同。與對照組比較，加入10 μg/L（t=3.657，P=0.022）、30 μg/L（t=7.483，P=0.002）、50 μg/L（t=4.821，P=0.009）、70 μg/L（t=7.7461，P=0.001）及90 μg/L（t=7.839，P=0.001）bFGF 實驗組均明顯高于對照組的增殖效應；實驗組中肌源性干細胞的增殖作用在10～70 μg/L 區間內隨終濃度升高而顯著增強（均P＜0.01）；但是從70 μg/L 到90 μg/L時其促增殖作用不再繼續增強，其間增值效應比較差異無統計學意義（P=0.374）。見圖4。

圖4 不同終濃度的外源性堿性成纖維細胞生長因子對大鼠陰莖肌源性干細胞的促增殖效應

討論

向多細胞系分化和自我更新潛能是肌源性干細胞的獨特之處，有研究發現即便是在無誘導因素作用下，其也可定向分化為肌細胞和肌組織［17］。要研究肌源性干細胞的增值，首先要精確地對其進行鑒定，Sca-1 是目前最常用于鑒定干細胞的標志物，而Desmin 是最常用于鑒定肌源性干細胞的標志物，可用于篩選肌肉來源與非肌肉來源的組織［18］。本實驗測定了大鼠陰莖海綿體中Sca-1 和Desmin 的表達情況，結果顯示少量存在Sca-1 和Desmin 同時表達的雙陽性細胞，即同一個細胞既具有干細胞特異性，又具有肌源性細胞的特異性，因此我們發現了海綿體組織中有肌源性干細胞存在的證據。但是，肌肉組織中肌源性干細胞的數量較少，因此，如何使得肌源性干細胞能夠在體外有效地得到純化、擴增、定向分化，成為目前研究肌源性干細胞增殖的熱點問題。

近期，bFGF 被廣泛用于細胞的體外培養增殖、誘導分化以及體外組織再生領域，是一種極具應用潛力的生長因子之一［10-12］。目前，諸多學者進行了利用bFGF 擴增的方法促進干細胞的增殖的研究，如李娜等［19］利用bFGF集落胚胎干細胞，促進其高效增從而獲得了豐富的造血干細胞；巴云濤等［20］對人臍帶Wharton's jelly 源的組織塊進行分離培養，應用bFGF對其增殖過程進行干預，培養出了可觀的具有間充質干細胞特性的細胞；呂丹等［21］已將外源性bFGF用于大鼠肌源性干細胞增殖研究，并取得了良好效果；王童等［22］將bFGF 作用于腦創傷SD 大鼠大腦側室中，發現神經干細胞的增殖與分化明顯提高。以上研究均充分證明bFGF 能促進細胞從組織塊的分離，且有助于促使細胞貼壁，而且一定程度上維持細胞形態穩定性，提高了細胞的增殖能力，并且未改變細胞的表面標志物表達，以便于進一步對細胞特性的鑒定。

結合以上研究，目前認為bFGF可促進肌源性干細胞的增殖與分化的作用機制可能為：（1）bFGF 保守性較強，在各種生物體內有著很高的同源性［12］，楊竣等［23］檢測出了大鼠血清及陰莖組中bFGF 的含量高達（10.53±0.42）μg/L 和（985.8±76.8）pg/mg protein，并發現其與陰莖海綿體肌的含量變化有著密切關系。（2）肌細胞中可能有bFGF 特異性受體存在［22］。生長因子通過與肌細胞上相應受體結合啟動肌細胞內信號轉導通路，或者與可溶性的相應受體結合，進而作用于其他具有bFGF 受體或類似受體的非神經元和非肌細胞，從而改變肌源性干細胞生存的微環境而發揮作用［24-27］。例如Xie等［28］以高脂血癥大白兔為研究對象，向其海綿體肌內注射bFGF 后發現其海綿肌含量及血管活性藥物的舒張程度明顯增加，并進一步檢測發現陰莖海綿體肌內血管內皮生長因子（VEGF）和神經元型一氧化氮合酶（nNOS）的蛋白表達水平明顯升高，發現bFGF 主要是通過促進VEGF 蛋白表達，導致其下游的蛋白激酶B 和eNOS 磷酸化，最終提高陰莖組織對血管活性藥物的敏感度。（3）bFGF 與受體結合后形成受體配體復合物，定位于細胞核后，作為一種細胞分裂原，在有絲分裂G2M期，其受體FGFR 是酪氨酸激酶型受體，與配體結合后激活c/Frs-Raf/MAPKKK-MAPKK-MAPK 通路，作用于RNA 聚合酶Ⅰ并影響其活性，導致核蛋白體基因的轉錄加強，加快了細胞周期的轉換，通過刺激引物合成刺激了細胞的DNA 合成增強，通過縮短細胞周期，從而促進細胞的分裂與增殖［29-30］。胡文龍等［31］發現bFGF 能夠調節人臍帶間充質干細胞的細胞周期；（4）bFGF 作為一種信號蛋白，通過靶向作用于相關miRNA 影響干細胞分裂和分化，如miR-138 和miR-23b 受bFGF 影響在干細胞成骨和成軟骨的增值、分化過程中發揮更顯著的作用［32］。

本研究中發現，bFGF 不僅可促進大鼠陰莖肌源性干細胞的增殖，而且其促進增值效應與培養時間、終濃度密切相關。我們發現：（1）bFGF 的促增殖效應隨培養時間的延長而逐漸升高，但并非隨時間延長而無限增加，當培養時間達到96 h時，增殖效應將不再繼續增加，這與bFGF 作為細胞分裂源的機制相一致。（2）肌源性干細胞的增殖效應與bFGF 終濃度呈正相關性，即增殖效應隨終濃度增大而一定限度內逐步提高。白燕等［33］在研究bFGF 對骨髓間充質干細胞成骨誘導作用時，發現bFGF 質量濃度達到10 μg/L 時會達到飽和狀態，產生結節的數量不會再隨質量濃度升高而增加，反而出現抑制作用。同樣，我們也發現肌源性干細胞的增殖效應隨著終濃度從10 μg/L～70 μg/L 升高的區間內也隨之增強，當終濃度達到70 μg/L時，其增殖效應達到巔峰，且不再繼續增加，反而有下降趨勢。即過高的終濃度不僅不會再對細胞分化產生促進作用，反而會產生抑制作用，這種現象與bFGF 受體具有特異性、飽和性的特點相一致，因此選擇合適的培養終濃度也至關重要。另外，因為bFGF 有著不穩定性的特點，隨著培養時間的延長，bFGF 的濃度也會隨之下降，便會減緩肌源性干細胞的增值、分化效率，所以在細胞培養基中需要持續補充bFGF 以維持其濃度，這也是十分重要的。

本研究初步探討了bFGF 對肌源性干細胞的促增殖作用，對肌源性干細胞培養方案優化的研究提供了些許經驗。但是，其增值作用是否具有靶向性，是否與其他物質具有聯合作用，且作用機制與效果如何，作用可控性等問題仍需進一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突