電針內關穴預處理對經皮冠狀動脈介入治療病人心肌保護作用的臨床研究

朱 怡，李 毅，東貴榮

心肌梗死是最嚴重的心血管疾病之一，是我國乃至全球重要的公共衛生問題，也是我國居民死亡的第二大病因[1]。隨著經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)的普及，心肌梗死病人的死亡率逐漸下降。PCI術能夠有效恢復梗死心肌的血液供應，減少心肌梗死面積，改善心臟功能，但同時缺血部位的心肌重新獲得血流供應后，常會產生不可逆的二次損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)，這些損傷可以引起嚴重的并發癥，如梗死面積增大、心室收縮功能降低、心律失常等，從而降低病人生存率[2]。因此，MIRI具有一定的危險性，如何預防或減少這種損傷，提高病人的生存質量，改善預后，是目前面臨的巨大考驗。現代醫學對MIRI的防治多采取缺血預處理及藥物干預等，但目前尚無定論。本研究通過探究電針內關穴預處理對冠心病PCI術病人心臟相關指標的影響，從臨床上證實電針預處理對防治MIRI的作用，以及探討可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年12月—2018年12月在上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院心內科確診為冠心病并擇期行PCI術的病人為候選受試對象，所有入選者均辦理常規入院，完成心內科常規入院檢查，按照排除標準排除部分病人，在入組試驗前告知病人本課題具體研究內容及相關可能的受益和風險，在取得病人、家屬的同意后，簽署知情同意書，最后納入病人60例，按照隨機數字表法分為電針預處理組和對照組(control group，CG)。本研究符合《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》《赫爾辛基宣言》和《人體生物醫學研究國際道德指南》的倫理原則，經上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院倫理委員會審查并批準，批號為2017-029。受試者了解本臨床試驗并自愿簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①確診為冠心病，年齡18～74歲；②紐約心臟病協會(NYHA)心功能分級Ⅰ～Ⅲ級；③擬行PCI術；④有能力履行知情同意手續，并簽署知情同意書。排除標準：①急診PCI病人；②非首次PCI術病人；③伴有嚴重的其他相關疾病(預期生存時間<12個月)；④精神障礙、意識障礙、行為障礙等不能合作者；⑤所需電針區域有皮膚過敏、破損等功能障礙者；⑥拒絕加入本研究者。中止或撤出標準：①未植入支架病人；②試驗中電針后出現暈針等相關針刺不良反應；③試驗中發生嚴重安全性問題；④試驗中發現臨床試驗方案操作失誤，難以評價針刺效果；⑤試驗管理原因。如符合下列任意1項即應剔除，不計入各觀察指標的評價：①未執行本試驗方案規定的受試者；②觀察項目不全且不能評價試驗效果及副反應的受試者。

1.3 治療方法 兩組病人均接受常規心內科藥物治療，本次試驗除電針預處理組行電針預處理外，不進行其他任何干預。

1.3.1 電針預處理組 術前1 h，囑病人取臥位或坐位，手臂內側面朝上，對電針預處理組病人的雙側內關穴和大陵穴進行電針預刺激。定位：大陵穴在腕橫紋中央，內關在腕橫紋上2寸，掌長肌腱與橈側腕屈肌腱之間。操作：將病人電針預處理處的皮膚用乙醇棉球擦拭，待殘留乙醇干燥后，針刺病人雙側內關穴、大陵穴，根據病人體型，針刺深度為0.5～1.0寸，采用平補平瀉法，連接低頻脈沖治療儀進行電針刺激30 min，內關穴接負極，大陵穴接正極，采用疏密波(疏波2 Hz，密波30 Hz)，電流強度以病人能耐受最大電流為適宜。電針治療結束后于我院數字減影血管造影(DSA)室行PCI治療。

1.3.2 對照組 不進行電針預處理。

1.4 相關檢測試劑及儀器

1.4.1 主要化學試劑 Trizol(invitrogen 1596-026)、DEPC處理水[基爾頓生物科技(上海)有限公司，R1600]、Ficoll液[基爾頓生物科技(上海)有限公司，R1603]、人淋巴細胞分離液(Solarbio P8610)、SYBR Green PCR 試劑盒(Thermo #K0223)、逆轉錄試劑盒(Fermentas #K1622)等。

1.4.2 主要實驗儀器 低頻脈沖治療儀(上海醫療器械技術公司，G6805-2型)、電動勻漿機(FLUKO PRO200)、低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16M)、旋渦振蕩器(青浦滬西儀器廠，K30)、Real-time檢測儀(ABI公司，ABI-7500)等。

1.5 觀察指標

1.5.1 心肌損傷相關指標 取電針預處理組病人和對照組病人術前和術后24 h靜脈血5 mL，常溫保存，離心后冷凍保存。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測兩組治療前后血清肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)濃度變化，所有試劑盒均購自美國R&D公司，檢測由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院檢驗科醫師嚴格按試劑說明書執行。

1.5.2 炎癥相關指標 取電針預處理組病人和對照組病人術前和術后24 h靜脈血5 mL，離心管中加入單核細胞分離液Ficoll液，離心后收集淋巴細胞并置于1.5 mL離心管中，冷凍保存，實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測病人治療前后外周血單核細胞Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)及核轉錄因子-κB(NF-κB)mRNA的表達。①外周血單核細胞分離。取抗凝血，用等體積磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋全血；在 15 mL離心管中加入5 mL單核細胞分離液Ficoll液，用巴氏吸管吸取等體積的稀釋后全血，小心加在分離液上，平鋪于分離液上層；2 000 r/min室溫離心20 min；觀察出現明顯分層，最上層為稀釋的血漿層，中間為透明的分離液層，血漿與分離液間的白膜層即為單核細胞層，下層為紅細胞和粒細胞，小心吸取白膜層細胞至15 mL離心管中，加入10 mL PBS液，用細胞凍存液重懸細胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清，重復上述操作2次；收集淋巴細胞置于1.5 mL離心管中，用于總RNA提取。②cDNA 第一條鏈的合成。總RNA中DNA的消除：按以下體系加入，DNaseI 1 μL；10×DNaseI Buffer 1 μL；總RNA≤1 ng；DEPC-H2O 4 μL；總體積10 μL。反應條件為37 ℃、30 min；加1 μL乙二胺四乙酸(EDTA)；65 ℃、10 min。RNA逆轉錄：將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為37 ℃、60 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min，體系為RNA-Primer Mix 12 μL、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTPs 1 μL、25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、200 U/μL M-MLV Rtase 1 μL和ddH2O(DNase-free)4 μL。③RT-PCR擴增：按照聚合酶鏈式反應(PCR)擴增試劑盒說明書擴增靶基因和內參基因，反應條件為95 ℃、10 min(95 ℃、15 s，60 ℃、45 s)×40；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s；反應體系為SYBRGreen Mix 12.5 μL，正向引物0.5 μL，反向引物 0.5 μL，ddH2O 9.5 μL和cDNA模板2 μL。數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software進行分析。引物序列見表 1。④基因相對表達量的計算。通過目的基因與內參基因的擴增動力學曲線確定擴增效率，采用比較Ct值法對樣品的擴增Ct值進行計算，帶入計算公式求出基因相對表達量。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 一般情況 入組病人共60例，因特殊原因脫落3例(2例因手術取消，1例簽署知情同意書后拒絕參加試驗)，故最終納入試驗57例。電針預處理組28例，男17例，女11例，年齡(64.61±6.30)歲；對照組29例，男17例，女12例，年齡(61.38±7.70)歲。兩組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 兩組血清cTnI、CK、CK-MB濃度比較 電針預處理組術前和術后血清cTnI比較，差異無統計學意義(P>0.05)。對照組PCI術后cTnI有升高趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。電針預處理組術前和術后血清CK濃度比較，差異有統計學意義(P<0.05)，電針預處理能降低PCI術后病人血清CK濃度；對照組術前與術后CK濃度比較，差異無統計學意義(P>0.05)；雖然兩組PCI術前后CK濃度差值比較差異無統計學意義(P>0.05)，但電針預處理能抑制PCI術后病人CK濃度升高。電針預處理組與對照組術后血清CK-MB表達均有一定程度降低，術前與術后比較差異有統計學意義(P<0.05)，兩組PCI術前后CK-MB濃度差值比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 兩組cTnI、CK、CK-MB濃度比較[M(Q1，Q3)] 單位：ng/mL

表3 兩組cTnI、CK、CK-MB術前與術后差值比較[M(Q1，Q3)] 單位：ng/mL

2.3 兩組外周血單核細胞中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA表達比較 兩組治療前外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA的表達比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)，電針預處理組和對照組術后外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA均上升，PCI術前后對比差異均有統計學意義(P<0.001)；但電針預處理組TLR4 mRNA術前與術后差值與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；電針預處理能有效降低PCI病人外周血單核細胞MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表達，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表4、表5。

表4 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA表達比較(±s)

表5 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA術前與術后差值比較(±s)

3 討 論

隨著社會現代化進程的加快、生活方式的改變、人口老齡化趨勢等諸多因素，心血管疾病的發生率逐年升高，我國心血管疾病患病率處于持續上升階段，根據2019年出版的《中國心血管健康與疾病報告》推算，我國心血管病現患病人數達3.3億例，2017年心血管病死亡率仍居首位，高于腫瘤及其他疾病，而心肌梗死是最嚴重的心血管疾病之一，隨著醫學的不斷發展，PCI術被廣泛應用于心肌梗死的臨床治療，但近年來的實驗室與臨床研究不斷證明，PCI術作為一種針對心肌梗死的有效治療措施也會導致MIRI[3-4]。MIRI是心肌組織在缺血恢復血流供應后，在各種原因和機制共同作用下，心肌組織發生結構損傷、代謝異常及功能障礙等，引起梗死面積增大、心律失常、心室重構及心力衰竭等嚴重并發癥，直接影響病人預后，降低病人生存率[5]，因此，如何減少或者避免MIRI是目前亟須解決的熱點問題。

MIRI發生機制較為復雜，細胞內鈣超載[6-7]、氧自由基暴發[8]、細胞凋亡[9-10]、細胞自噬[11-14]和細胞壞死[15-16]、炎癥[17-19]等因素是MIRI發生和發展的重要原因，各損傷因素之間相互作用，共同導致了心肌細胞結構和功能的損傷。其中，與先天免疫及炎癥反應密切相關的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被證實影響著心室重構和心臟功能，在MIRI中起重要作用[20-22]，研究顯示，MIRI大鼠心肌細胞中TLR4、MyD88及NF-κB表達增高，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能提高炎癥反應，影響缺血心肌功能的恢復，削弱或抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能減輕MIRI程度[23-24]。cTnI是判定MIRI的一個敏感且高度特異性的指標，當心肌細胞受損傷時，游離的cTnI釋放入血液，隨著損傷的加重，結合部分的cTnI也釋放入血液，因此，病人cTnI會持續增高[25-26]；CK較多存在于骨骼肌、平滑肌和心肌細胞的細胞質和線粒體中，與細胞內能量轉運、三磷酸腺苷(ATP)再生和肌肉收縮密切相關，急性心肌梗死病人血清中CK含量增高；CK-MB也會釋放入血，CK-MB僅存在于心肌細胞中，因此，檢測血清中CK和CK-MB的含量可作為判斷心肌細胞損傷的重要輔助手段[27-28]。

既往研究證實，電針內關穴可以通過降低鈣離子超載、減少心肌細胞凋亡、抗氧化應激反應、抗炎等多種機制，有效保護心肌，改善心臟功能。本研究結果顯示，PCI術后病人血清cTnI、CK及外周血單核細胞TLR4、MyD88 和 NF-κB mRNA表達均有一定程度的升高，說明 PCI術后病人在一定程度上發生了MIRI；電針內關穴預處理能有效抑制PCI術后病人血清 cTnI和CK濃度。說明電針內關穴能保護MIRI心肌；并且電針預處理能有效降低外周血單核細胞MyD88、NF-κB mRNA表達，以及對TLR4 mRNA表達也有一定的抑制作用，以上均說明電針內關穴預處理能有效抑制PCI術后病人發生MIRI的程度，預防MIRI，其作用機制可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關。

在以往關于內關穴改善MIRI的研究中，多以實驗研究為主，通過本次臨床觀察研究，從臨床上進一步證實了電針預處理內關穴對冠心病行PCI術病人心肌有保護作用，這為今后在臨床上如何有效地預防MIRI，提高冠心病行PCI術病人的臨床預后，提供了新思路。本試驗缺少術后長期隨訪，尚未跟蹤記錄病人心臟超聲、心力衰竭發生率、生存率等指標，將在今后進行進一步深入研究。