基于網絡藥理學和分子對接探討金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的作用機制

楊 闖，馬新宇，吳文勝

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由病毒感染導致的心肌局灶性或彌漫性病變，臨床上病人癥狀差異明顯，表現可從輕者的無癥狀到重者出現充血性心力衰竭甚至心源性猝死[1]。據統計，病毒性心肌炎的發病率為10/10萬～22/10萬[2]。2013年全球報告的心肌炎病例為150萬例[3]。西醫根據病毒性心肌炎的病因、病理、臨床癥狀等，主要應用抗病毒治療、免疫抑制治療和免疫調節治療3種治療方法[4]。近年來，中醫藥在病毒性心肌炎的治療上取得了一定進展[5]。

中醫根據病毒性心肌炎的病因病機及臨床表現等，可將該病歸屬于“溫病”和由“溫病”引起的“心悸”“胸痹”等范疇[6]。《黃帝內經》曾論述到：“復感于邪，內舍于心”，指出外感邪氣可以引起心臟疾病。中醫認為病毒性心肌炎多是由邪毒外侵，熱毒入里，內侵于心而引起，臨床上對于此類熱毒侵心型病毒性心肌炎治療多選用中藥復方銀翹散進行加減。李文等[7]臨床觀察證實銀翹散可以改善急性病毒性心肌炎病人的中醫證候、左心室收縮功能、室性期前收縮及調節心臟自主神經功能。田明明等[8]臨床觀察證實銀翹散加減治療小兒風熱犯心型病毒性心肌炎臨床療效及心肌酶譜改善效果均明顯高于對照組。銀翹散出自清代著名溫病醫家吳鞠通的《溫病條辨》一書，方中金銀花、連翹共為君藥，都具有辛涼解表、清熱解毒的功效。現代藥理學研究發現，金銀花具有抗炎、抗氧化、抗紫外線損傷、降血脂、降血糖、抗病毒等作用[9]。連翹具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[10]。婁序笙等[11]的動物實驗證明，金銀花可明顯抑制病毒性心肌炎小鼠核轉錄因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3，CASP3)的表達。張益靈[12]的動物實驗證明，貫葉連翹提取物可以緩解免疫性心肌炎小鼠心肌免疫損傷和減輕心肌炎癥程度。盡管中藥金銀花、連翹被廣泛應用于病毒性心肌炎的治療中，但到目前為止，中藥金銀花、連翹治療病毒性心肌炎的作用機制并不明確。本研究旨在通過網絡藥理學來尋找金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的活性成分和作用靶點，并采用分子對接技術進行驗證，來探討金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的潛在機制，為進一步研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 金銀花、連翹藥物成分和藥物靶點的獲取與篩選 通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫，查找金銀花、連翹的有效成分及靶點，按照化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為中藥有效成分濾過條件[13]。利用perl軟件整合金銀花連翹有效成分及靶點。在UniProt數據庫的UniProtKB功能(https：//www.uniprot.org/uniprot/)中篩選“Human”“Reviewed”基因庫并下載，利用perl軟件來過濾金銀花、連翹潛在靶點。

1.2 藥物作用疾病靶點的獲取 以“viral myocarditis”為關鍵詞在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數據庫、OMIM(https：//www.omim.org/)數據庫、pharmGKB(https：//www.pharmgkb.org/)數據庫獲取病毒性心肌炎的疾病靶點，去重合并各數據庫疾病靶點，并應用R軟件安裝Venn包來繪制Venn圖。之后利用R軟件篩選金銀花-連翹與病毒性心肌炎的共同靶點，并繪制Venn圖。

1.3 構建“藥物成分-作用靶點”網絡關系圖 將獲得的藥物活性成分和作用靶點導入到Cytoscape 3.9.0軟件中，使用Cytoscape 3.9.0軟件構建“藥物成分-作用靶點”網絡關系圖。

1.4 繪制蛋白互作(PPI)網絡并篩選PPI網絡核心靶點 將藥物作用疾病的作用靶點導入STRING(https：//cn.string-db.org/)網站中，限制物種為“Homo Sapiens”繪制PPI網絡。利用Cytoscape 3.9.0軟件中的CytoNCA插件對PPI網絡進行拓撲分析，并聯合R軟件找出每個條件大于中位值的基因。重復篩選，最終獲得該網絡的核心靶點，即為藥物作用的關鍵靶點。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析 在R軟件中安裝BiocManager軟件包，然后安裝org.Hs.eg.db包，利用“org.Hs.eg.db”將藥物作用疾病的作用靶點轉換為entrezID。利用R軟件的BiocManager軟件包安裝colorspace包、stringi包、ggplot2包、DOSE包、clusterProfiler包、enrichplot包，通過轉換得到的entrezID，以Q<0.05、P<0.05進行GO富集分析并繪制柱狀圖。利用R軟件安裝pathview包，通過轉換得到的entrezID，以Q<0.05，P<0.05進行KEGG富集分析并繪制柱狀圖及獲取關鍵通路的通路圖。

1.6 分子對接 將金銀花、連翹治療病毒性心肌炎的5個關鍵活性成分槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)，通過PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載以上5個活性成分的分子結構，并使用Chem3D軟件進行能量最小化處理，保存為mol2格式。在14個PPI網絡關鍵靶點中，根據度值(Degree)的高低取前5個關鍵靶點進行分子對接。使用UniProt(https：//www.uniprot.org/)數據庫對5個關鍵靶點進行檢索，篩選條件為“Human”“Reviewed”。并在PDB(https：//www.rcsb.org/)數據庫下載關鍵靶蛋白的PDB格式文件，依次為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG，PDB ID：1ZGY)、轉錄因子AP-1(JUN，PDB ID：6Y3V)、CASP3(PDB ID：1NME)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1，PDB ID：1H10)、細胞間黏附分子1(ICAM1，PDB ID：5MZA)。利用SYBYL-X 2.0軟件進行分子對接并根據連接性能進行評分，從而推測藥物活性成分與靶點蛋白的結合方式。

2 結 果

2.1 金銀花、連翹藥物成分和藥物靶點的獲取與篩選 藥物有效成分經OB≥30%和DL≥0.18條件篩選后，從TCMSP數據庫中查找到金銀花靶點1 647個、有效成分23個，獲得連翹靶點1 425個、有效成分23個。利用perl軟件整合金銀花、連翹有效成分及靶點后，將金銀花、連翹活性成分對應的靶點與UniProt基因庫相匹配，共過濾出214個藥物靶點。

2.2 藥物作用疾病靶點的獲取 以“viral myocarditis”為關鍵詞，在GeneCards數據庫、pharmGKB數據庫、OMIM數據庫進行疾病靶點檢索。其中GeneCards數據庫檢索結果以Relevance score>1進行過濾。將3個數據庫檢索結果整合去重后共獲得疾病靶點747個，各數據庫獲取疾病靶點情況繪制Venn圖(見圖1)。通過R軟件篩選到金銀花-連翹與病毒性心肌炎共同靶點77個，并繪制Venn圖(見圖2)。

圖1 數據庫疾病靶點獲取情況Venn圖

圖2 藥物-疾病共同靶點Venn圖

2.3 “藥物成分-作用靶點”網絡構建與分析 將金銀花-連翹的藥物活性成分和作用靶點導入Cytoscape 3.9.0軟件中，繪制“藥物成分-作用靶點”網絡關系圖(見圖3)。該網絡中共有101個節點、201條邊、24個入血成分和77個靶點。根據入血成分的Degree值由高到低進行排序，選取前5個，依次為槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)作為金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的關鍵入血成分。

圖3 “藥物成分-作用靶點”網絡關系圖

2.4 繪制PPI網絡并篩選PPI網絡核心 在STRING網站繪制PPI網絡關系圖(見圖4)。經兩次Cytoscape 3.9.0軟件的CytoNCA插件拓撲分析聯合R軟件的重復篩選后，最終獲得14個核心靶點(見圖5)，包括PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1等， 即為金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的關鍵靶點。

圖4 PPI網絡關系圖

圖5 核心靶點篩選

2.5 GO富集分析 將77條信號通路經R軟件運行后進行GO富集分析，選取生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)3部分，共確定與病毒性心肌炎發生發展過程密切相關的條目2 355個。每個部分選取富集最顯著的10個繪制GO富集條形圖(見圖6)。分別得到BP 2 193條，主要條目包括對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、對細菌來源分子的反應(response to molecule of bacterial origin)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、對金屬離子的反應(response to metal ion)、對氧化應激的反應(response to oxidative stress)、細胞對氧化應激的反應(cellular response to oxidative stress)等。得到CC 47條，主要條目包括薄膜閥(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、膜區(membrane region)、小凹(caveola)、轉錄調節復合物(transcription regulator complex)等。得到MF 115條，主要條目包括DNA轉錄結合因子結合(DNA-binding transcription factor binding)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、磷酸酶結合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶結合(protein phosphatase binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等。

圖6 GO富集分析結果

2.6 KEGG富集分析 將77條信號通路經R語言運行后共富集到151條KEGG通路，選取富集最顯著的前30個繪制條形圖(見圖7)。KEGG富集結果顯示，金銀花-連翹治療病毒性心肌炎可能的作用通路主要富集在脂質與動脈粥樣硬化通路(lipid and atherosclerosis)、糖尿病并發癥中的衰老信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切力與動脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、白細胞介素-17(1L-17)信號通路(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等信號通路。其中，脂質與動脈粥樣硬化通路圖見圖8。

圖7 KEGG富集分析結果

圖8 脂質與動脈粥樣硬化通路圖

2.7 分子對接結果 使用SYBYL-X 2.0軟件分別處理關鍵靶蛋白的PDB文件，刪除水分子、添加氫鍵、提取配體分子并創建活性口袋，從而獲得核心蛋白的可靠對接模型。將槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素 5個關鍵入血活性成分分別和核心靶點PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1進行分子對接，并導出對活性成分-核心靶點連接性能進行評分的Total_Score表(見表1)，來判斷活性成分-核心靶點的連接性能。選取與核心靶點連接性能Total_Score評分較高的活性成分，分別為PPARG-漢黃芩素、JUN-槲皮素、CASP3-槲皮素、AKT1-漢黃芩素、ICAM1-木犀草素構成對接圖(見圖9)。對接結果顯示：關鍵活性成分與核心靶點能夠通過氫鍵進行結合，可以形成穩定的空間結構。

表1 活性成分-核心靶點連接性能Total_Score 單位：分

圖9 分子對接圖

3 討 論

金銀花、連翹是我國歷史悠久的中藥材，《神農本草經》中記載：“金銀花性寒味甘，具有清熱解毒、涼血化瘀之功效，主治外感風熱、瘟病初起、瘡瘍疔毒、紅腫熱痛、便膿血”。《神農本草經》中記載連翹“主寒熱，鼠痿，瘰疬，癰腫惡瘡，癭瘤，結熱”。現代研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗病原微生物、增強免疫功能、抗機體毒素等藥理作用[14]，金銀花中的有效成分木犀草苷對心血管系統有著明顯的保護作用[15-18]。連翹具有抗菌抗炎、抗病毒、保肝等藥理作用[19]，連翹的有效成分異連翹酯苷、連翹酯苷都具有較強的抗氧化、抗菌能力[20]。因為金銀花、連翹主要功效在于辛涼解表、清熱解毒，所以常被用于溫病初期和中期的治療。病毒性心肌炎致病病毒多由腸道病毒(尤其是柯薩奇病毒)、腺病毒、細小病毒B19、人類皰疹病毒等導致[21]。病人發病之初多有體溫升高、咳嗽、咽喉部不適等癥狀，病因、病機及癥狀表現與溫病初期風熱犯表證大致相同，因此，金銀花、連翹常被用于病毒性心肌炎的治療。盡管目前沒有關于病毒性心肌炎與溫病關系的系統論述，但許多醫生對于病毒性心肌炎的診療在溫病原則指導下，均取得了很好的臨床療效[22]。

本研究涉及了金銀花-連翹的24個活性成分，根據入血成分的Degree值得到槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、β-胡蘿卜素等關鍵入血成分。其中，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡蘿卜素為金銀花-連翹兩藥共有成分。槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素是黃酮類化合物，黃酮類化合物已被證明對高血壓、炎癥、糖尿病和心血管疾病有效[23]。槲皮素可通過H9c2細胞中的信號轉導因子、轉錄激活因子1以及絲裂原活化蛋白激酶途徑來有效減輕腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的損傷，發揮在心肌炎中的保護作用[24]。木犀草素可通過抑制炎癥來抑制柯薩奇病毒B3(CVB3)復制[25]。山奈酚可通過減輕血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)引起的炎癥和氧化應激來防止AngⅡ引起的心臟重塑[26]。漢黃芩素可通過激活核因子E2相關因子2(Nrf2)介導的抗氧化反應來抑制心肌肥大[27]。低劑量的β-胡蘿卜素可調節炎癥，減少胱天蛋白酶信號，并與心肌細胞系中的自噬激活相關[28]。本研究涉及77個潛在藥物作用靶點，GO富集分析發現金銀花、連翹藥對通過77個作用靶點參與病毒性心肌炎的多種生物學過程，KEGG分析得到脂質與動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發癥中的衰老信號通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化通路等151條通路。篩選出PPARG、JUN、CASP3、AKT1、ICAM1等14個核心靶點。分子對接表明關鍵活性成分與核心靶點能夠形成穩定的空間結構。其中ICAM1結合能力最強。有研究顯示，ICAM1在CVB3引起的急性病毒性心肌炎小鼠的心肌細胞表達中起關鍵作用[29]。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學方法對金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的有效成分、作用靶點及作用通路進行了研究，證明了中藥金銀花、連翹藥對對病毒性心肌炎的治療具有多成分-多靶點-多途徑的特點，為今后深入探究金銀花、連翹藥對治療病毒性心肌炎的作用機制提供了依據和參考。但是，本次研究沒有考慮到中藥活性成分的含量問題，同時只是選取了部分成分及靶點進行分子對接來驗證，具有一定的局限性。