赤芍總苷對腦出血大鼠神經功能損傷的改善及對腦組織中Treg/Th17比例的影響

賈傳宇，王舒陽，管海博

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種非創傷性血管破裂，導致血液在腦實質內聚集的高發病率、高死亡率和高致殘率的常見難治性腦血管疾病之一[1]。腦出血后能激活小膠質細胞分泌大量毒性物質，進而引起腦水腫、神經元損傷和神經功能損傷[2]。研究表明，炎癥在腦出血誘發的繼發性損傷中起著重要作用，并且活化的小膠質細胞釋放的炎性因子加劇了中樞神經系統的神經損傷[3]。輔助性T細胞17(Th17)和調節性T細胞(Treg)是兩類重要的CD4+T細胞免疫細胞亞群[4]。Th17細胞能夠促進炎癥反應，主要分泌白細胞介素(IL)-17等炎性因子，而Treg細胞能夠抑制炎癥反應，主要分泌IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)等炎性因子，機體穩定時，Treg/Th17相對平衡，平衡被打破則會引起多種疾病[5]。近年來，臨床治療腦出血困難，但一些中藥對治療腦出血表現出良好的效果，赤芍就是治療腦出血的藥物之一。赤芍具有抗凝、抗栓和改善血液循環的功效，其有效成分為芍藥苷、芍藥新苷、芍藥花苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷等單萜苷類化合物，統稱赤芍總苷(total paeony glycoside，TPG)[6]。本研究通過探索赤芍總苷對腦出血大鼠神經功能損傷的改善及對腦組織中Treg/Th17比例的影響，為赤芍總苷治療腦出血提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只無特定病原體(SPF)級成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質量260～300 g，由北京維通利華實驗動物公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均飼養于溫度、濕度適宜的清潔無菌環境，自由飲水和攝取食物。所有實驗均獲得醫院倫理委員會同意。

1.2 儀器與試劑 腦立體定位儀購于美國Stoelting公司；水合氯醛、乙醇、甲醛均購自北京益利精細化學品有限公司；IL-17、IL-10和TGF-β 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒均購自賽默飛世爾科技公司；大鼠抗CD3 APC、CD4 FITC、CD8 PerCP、CD25 APC、FoxP3 PE、IL17A PE均購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與造模 選取50只SPF級成年SD雄性大鼠，隨機分為5組：空白組、腦出血組、赤芍總苷高劑量組、赤芍總苷中劑量組和赤芍總苷低劑量組，每組10只。腦出血大鼠造模參照自體血局部注入法進行[7]。空白組：正常飼養大鼠；腦出血組：使用10%的水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定于腦立體定位儀上，剪毛消毒后，在頭皮正中線上縱向切開10 mm露出前囟，然后在前囟的前0.2 mm、右3.0 mm處使用三棱針鉆開顱骨，進針深度為5.5 mm，直徑為0.5 mm。在尾尖0.5 cm處斬斷鼠尾，取100 μL血，以10 μL/min的速度緩慢注入，留針15～20 min后緩慢退出，用骨蠟封閉顱骨，縫合皮膚并消毒。赤芍總苷高劑量組：同腦出血組方法制造腦出血模型，于造模1 h后腹腔注射200 mg/kg赤芍總苷，每日1次，連續7 d；赤芍總苷中劑量組：同腦出血組方法制造腦出血模型，于造模1 h后腹腔注射100 mg/kg赤芍總苷，每日1次，連續7 d；赤芍總苷低劑量組：同腦出血組方法制造腦出血模型，于造模1 h后腹腔注射50 mg/kg赤芍總苷，每日1次，連續7 d。

1.3.2 神經功能損傷評估 參照Bederson評分[8]方法，于造模后6 h、1 d、2 d、3 d、7 d進行神經功能損傷評分。評分標準如下，0級：無神經功能損傷，計0分；1級：大鼠前肢出現彎曲，計1分；2級：前肢抵抗對側推力減弱，計2分；3級：前肢抵抗對側推力減弱，有旋轉現象，計3分。

1.3.3 腦組織蘇木精-伊紅(HE)染色 將大鼠麻醉后取出大腦，放入福爾馬林溶液中固定，經過脫水和包埋后，制作石蠟切片(厚度為5 μm)，然后進行HE染色，再使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后使用中性樹膠封片，并在光學顯微鏡下觀察腦組織。

1.3.4 ELISA法檢測腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β的含量 將大鼠麻醉后取出大腦，立即置于液氮研磨，提取蛋白，使用ELISA法按照試劑盒說明書檢測腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β的含量。

1.3.5 流式細胞術檢測腦組織中Treg/Th17的變化 將大鼠麻醉后取出大腦，使用生理鹽水沖洗腦組織，剪碎放入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入1 mL 0.25%的胰酶，在37 ℃放置10 min；加入血清終止后，使用30目尼龍網過濾并離心，使用PBS稀釋成單細胞懸液，并調整細胞濃度至5×109/L。取單細胞懸液，離心后用4%的多聚甲醛固定30 min，然后使用0.1%的Triton X-100處理15 min，再使用10%牛血清白蛋白(BSA)-PBS重懸。使用CD3+、CD8-、IL-17A+標記Th17細胞，CD4+、CD25+、FoxP3+標記Treg細胞，然后采用流式細胞儀檢測Th細胞亞群比例。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能損傷評分 與空白組相比，腦出血組各個時間段大鼠神經功能損傷評分明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在造模后6 h、1 d和2 d，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組大鼠神經功能損傷評分與腦出血組相比差異均無統計學意義(P>0.05)；在造模后3 d和7 d，與腦出血組相比，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組大鼠神經功能損傷評分明顯降低，且差異均有統計學意義(P<0.05)；赤芍總苷低劑量組各時間段大鼠神經功能損傷評分與腦出血組相比差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經功能損傷評分(±s) 單位：分

2.2 各組大鼠腦組織一般病理形態學光學顯微鏡下觀察結果 空白組大鼠腦組織細胞排列整齊有序，染色均勻，未見間質水腫和炎性細胞浸潤；腦出血組大鼠腦組織疏松，排列不整齊，細胞呈氣球樣變，壞死，且神經細胞變性、壞死，有明顯間質水腫和炎性細胞浸潤現象；赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組大腦組織病變明顯改善，神經細胞變性、壞死數量減少，炎性細胞浸潤明顯減輕；赤芍總苷低劑量組腦組織疏松有所改善，但排列仍不整齊，神經細胞變性、壞死數量未見明顯減少，炎性細胞浸潤也未明顯減少。

2.3 ELISA法檢測腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β的含量 與空白組相比，腦出血組腦組織中IL-17含量明顯升高，IL-10和TGF-β含量明顯降低，且差異均有統計學意義(P<0.05)；與腦出血組比較，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組腦組織中IL-17含量明顯降低，IL-10和TGF-β含量明顯升高，且差異均有統計學意義(P<0.05)；赤芍總苷低劑量組大鼠腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β含量與腦出血組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β含量比較(±s) 單位：ng/mL

2.4 流式細胞術分析腦組織Th17和Treg的比例 與空白組相比，腦出血組單個腦組織細胞液中Th17比例和Th17/Treg比值明顯升高，Treg比例明顯降低，且差異均有統計學意義(P<0.05)；與腦出血組相比，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組單個腦組織細胞液中，Th17比例和Th17/Treg比值明顯降低，Treg比例明顯升高，且差異均有統計學意義(P<0.05)；赤芍總苷低劑量組在單個腦組織細胞液中Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比值與腦出血組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠單個腦組織細胞液中Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比值比較(±s)

3 討 論

腦出血是腦血管疾病腦卒中的第二大類型，具有高發病率、高死亡率和高致殘率的特點，腦出血后易出現炎性反應，其中，炎性介質可通過損傷腦組織破壞腦屏障或加重腦水腫導致腦損傷[9]。Th17細胞和Treg細胞能夠分泌多種炎性因子，且Th17/Treg平衡在炎癥反應中也起著重要的作用[10]。赤芍總苷具有調節免疫力、消炎和鎮痛等作用[11]。本研究探索赤芍總苷對腦出血大鼠神經功能損傷的改善及對腦組織中Treg/Th17比例的影響，從而為治療腦出血藥物的赤芍總苷提供一定的理論依據。

由大鼠腦組織病理切片圖和神經功能評分可知，赤芍總苷對腦出血大鼠神經功能損傷具有改善作用，赤芍總苷具有神經保護作用，可抑制腦出血后水腫的發生。其機制尚未明確，具體機制還需要進一步研究，但赤芍總苷的芍藥苷能調節G蛋白偶聯受體(GPCR)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)/核轉錄因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Janus激酶2(JAK2)/信號轉導和轉錄活化因子(STAT3)等信號通路[12]。

有研究表明，缺血性腦卒中病人的外周血中有Th17/Treg功能失衡的表現[13]。本研究中，腦出血大鼠腦組織中Th17細胞和其分泌的炎性因子IL-17增加；而Treg細胞和其分泌的炎性因子IL-10、TGF-β減少，Th17/Treg細胞比值明顯升高，為Th17/Treg平衡參與腦出血的生理病理過程提供了新依據。本研究還表明，赤芍總苷可顯著降低Th17細胞和其分泌的炎性因子IL-17水平；而Treg細胞和其分泌的炎性因子IL-10、TGF-β水平明顯升高，說明赤芍總苷將炎癥環境變為抗炎狀態，從而改善腦出血癥狀。有研究表明，結腸炎也與Th17和Treg細胞之間的平衡有關，而赤芍總苷可以通過調節Th17/Treg細胞的分化和細胞因子的分泌而改善結腸炎[14]。

有關赤芍總苷改善腦出血的研究極少，本研究為赤芍總苷改善腦出血癥狀提供了一定的依據，但本研究有一定不足之處：只研究了赤芍總苷調節Th17/Treg平衡，其具體機制尚未清晰，還需要進一步研究。