補陽還五湯對線栓大鼠模型腦損傷和血腦屏障通透性的影響

鄭文旭，張保朝，李富慧，方 立

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是臨床常見腦血管疾病，致殘率、病死率極高，臨床調查顯示，我國70%左右腦血管疾病病人屬于缺血性腦卒中，缺血性腦卒中的預防和治療形勢十分嚴峻[1]。研究顯示，急性缺血性腦卒中后瀑布效應引起的血腦屏障通透性增加及隨之繼發的腦水腫是導致疾病高致殘率和病死率的主要原因[2-3]。因此，缺血性腦卒中搶救過程中，除及時溶栓治療外，減輕血腦屏障通透性破壞對減輕缺血性腦卒中繼發性腦損傷十分重要。近年來，中醫藥因低毒、來源廣泛、效果明顯等優勢在臨床中已廣泛用于心腦血管等疾病的防治。缺血性腦卒中屬中醫“中風”范疇，本病多為本虛標實，以氣血逆亂、氣化停滯、氣虛血瘀為基本病機，故治療應以益氣活血為要[4]。補陽還五湯是由清代王清任創立的益氣活血經典名方，具有抗氧自由基毒性、增加心腦血管血流量、改善微循環等作用，臨床已廣泛用于腦卒中后遺癥的治療，療效確切[5]。本課題組前期臨床研究顯示，補陽還五湯治療缺血性腦卒中病人，可有效改善病人臨床癥狀和體征，療效確切，但其具體作用機制尚不明確[6]。為此，本研究采用線栓法復制大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，通過補陽還五湯干預，評估補陽還五湯對MCAO腦損傷及血腦屏障通透性的影響，并進一步探討其調控機制，為臨床應用補陽還五湯治療缺血性腦卒中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，75只，4周齡，體質量180～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號SCXK(京)2019-0008，使用許可證號SYXK(京)2019-0022。動物實驗操作符合減少、替代、優化3R原則。

1.1.2 藥物制備 補陽還五湯煎劑：黃芪120 g，當歸尾6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，加水浸泡4 h，水煎2次，煎液濃縮至生藥含量為2 g/mL，pH 7.0。中藥藥材由河南中醫學院第一附屬醫院提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 注射用血塞通凍干粉(黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，國藥準字Z20026437，400 mg)，神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(美國Mybiosource公司)，伊文思藍[EVans Blue，EB，阿拉丁試劑(上海)有限公司]，兔抗大鼠Wnt3a、β-連環蛋白(β-catenin)、水通道蛋白-4(AQP-4)、緊密連接相關蛋白(Claudin-5)多抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術有限公司)。DYY-12D型電泳儀、水平電泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預 75只SD大鼠隨機分為假手術組、MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組，每組15只，除假手術組未進行栓塞外，余各組采用線栓法建立MCAO大鼠模型。取建模成功大鼠，MCAO組13只，補陽還五湯組13只，血塞通組14只，聯合組14只，均于術后2 h進行干預。補陽還五湯組按5 mL/kg體質量灌胃補陽還五湯煎液(含生藥2 g/mL)，每日1次，連續7 d；血塞通組尾靜脈注射10 mg/kg體質量的血塞通注射液，每日1次，連續7 d；聯合組灌胃補陽還五湯煎液后2 h尾靜脈注射血塞通，給藥劑量及給藥方式同前。

1.2.2 MCAO模型制備 采用線栓法建立MCAO模型[7]：戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，頸部剃毛備皮，頸部正中切口，鈍性分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，從左側頸總動脈近心端及頸外動脈分叉處用手術線結扎，然后在頸總動脈分叉處開一小口，將灼燒光滑的一端從切口處緩慢向入顱方向推進，推進18～20 cm遇阻力時停止(假手術組僅推進1 cm)，手術線結扎固定尼龍線，清理術區，縫合傷口并消毒。大鼠清醒后，采用Longa法評估各組神經功能，無神經系統異常表現計0分；不能完全伸展右側前爪計1分；行走時旋轉計2分；行走傾倒計3分；無自發活動或意識昏迷計4分；以評分1～4分為建模成功，剔除術中或術后24 h內死亡大鼠。

1.2.3 大鼠行為學評估 給藥1 d、3 d、7 d采用Longa法評估各組神經功能，評估方法同前述；采用貼紙去除實驗評估大鼠感覺功能[8]：將大鼠放置于50 cm×50 cm方形箱子中，適應5 min后，將貼紙貼在雙側前肢遠端放射狀區域，放回箱子，攝像頭記錄雙側貼紙所需時間，若120 s內未去除貼紙則計120 s，每只大鼠測試5次，每次間隔5 min，取平均值。

1.2.4 血清中樞神經特異性蛋白(S-100β)、NSE水平檢測 給藥1 d、3 d、7 d，大鼠尾靜脈采血2 mL，室溫靜置分層后，3 500 r/min離心8 min，離心半徑10 cm，取血清采用酶聯免疫吸附法檢測待測血清樣本，按照試劑盒說明書步驟操作，于酶標儀450 nm波長處測定吸光度值，依據標準曲線計算待測血清中S-100β、NSE含量。

1.2.5 血腦屏障通透性檢測 給藥7 d末次采血完畢后，每組隨機取7只大鼠，采用EB染色檢測各組血腦屏障通透性。按照4 mL/kg尾靜脈注射質量分數2% EB溶液，2 h后，腹腔麻醉大鼠，剖開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，從左心室灌注生理鹽水，至灌注液無色透明。冰上斷頭取腦，矢狀縫切開左右腦，稱重后加入1 mL/100 mg腦組織的甲酰胺溶液，37 ℃恒溫箱孵育48 h，勻漿后，12 000 r/min離心20 min(離心半徑12 cm)，取上清液于620 nm波長處檢測光密度值，根據EB標準品繪制標準曲線，計算EB含量(μg/mL)。

1.2.6 腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表達量檢測 給藥7 d末采血完畢后，每組隨機取6只大鼠，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法檢測腦組織各基因表達情況。脫臼處死大鼠，冰上分離腦組織，取缺血側腦組織，Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，逆轉錄獲得cDNA并以之為模板進行擴增，按照試劑盒說明配置反應體系，反應條件：94 ℃預變性5 min；40個重復(94 ℃變性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s)；72 ℃再延伸5 min。2-△△CT法計算目的基因Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5的相對表達強度。Wnt3a、β-catenin以β-actin為內參對照，AQP-4、Claudin-5以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參對照。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表達量檢測 采用蛋白質免疫印跡(Western Blot)法檢測腦組織中各蛋白表達情況。取缺血側腦組織，液氮中研磨并轉至離心管，加入細胞裂解液冰上裂解25 min，4 ℃預冷離心機12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液進行蛋白定量；取50 μg待測樣本與等體積上樣緩沖液混勻后，沸水浴8 min，12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉儀轉至硝酸纖維素膜上，加入封閉液室溫封閉2 h，加入稀釋一抗[Wnt3a、β-catenin(1∶300)，AQP-4、Claudin-5(1∶500)]，4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次×10 min后，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，常溫孵育2 h，于暗室中曝光顯影。掃描膠片后采用Image J圖像分析軟件分析各條帶灰度值，Wnt3a、β-catenin與內參β-actin灰度值比值及AQP-4、Claudin-5與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況觀察 75只大鼠參加實驗，假手術組15只大鼠全部存活，MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組分別剔除建模失敗或死亡大鼠2只、2只、1只、1只，其余大鼠參與后續實驗。假手術組術后蘇醒精神狀態逐漸轉好，術后1 d精神狀態逐漸恢復；MCAO組出現喜臥、精神萎靡、局部毛發脫落、對外界刺激不敏感、行為能力下降等現象，隨著觀察時間延長無明顯改善；補陽還五湯組、血塞通組及聯合組給藥期間精神狀態有所恢復，行為能力及反應能力有所恢復，隨給藥時間延長逐漸好轉，且聯合組好轉最為明顯。

2.2 大鼠行為學評估 與假手術組比較，MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組給藥1 d、3 d、7 d神經功能評分及貼紙去除時間均升高(P<0.05)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組給藥3 d、7 d神經功能評分及貼紙去除時間均降低(P<0.05)；與補陽還五湯組和血塞通組比較，聯合組給藥3 d、7 d神經功能評分及貼紙去除時間均降低(P<0.05)，補陽還五湯組與血塞通組給藥1 d、3 d、7 d比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。隨著給藥時間的延長，MCAO組神經功能評分及貼紙去除時間無明顯變化(P>0.05)，聯合組逐漸降低(P<0.05)；補陽還五湯組和血塞通組給藥7 d神經功能評分及貼紙去除時間明顯低于給藥1 d和給藥3 d(P<0.05)，給藥1 d與給藥3 d無明顯變化(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組大鼠神經功能評分比較(±s) 單位：分

表3 各組大鼠貼紙去除時間比較(±s) 單位：s

2.3 各組大鼠血清腦損傷標志物水平比較 與假手術組比較，MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組血清S-100β、NSE水平均升高(P<0.05)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組血清S-100β、NSE水平均降低(P<0.05)；聯合組血清S-100β、NSE水平低于補陽還五湯組、血塞通組，血塞通組S-100β、NSE水平低于補陽還五湯組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清腦損傷標志物水平比較(±s) 單位：μg/L

2.4 各組大鼠血腦屏障通透性比較 假手術組、MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織中EB含量分別為(1.25±0.20)μg/mL、(9.12±1.13)μg/mL、(7.68±1.04)μg/mL、(7.05±1.06)μg/mL、(6.11±1.12)μg/mL，組間比較差異有統計學意義(F=134.467，P<0.001，n=7)。與假手術組比較，MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組EB含量均升高(t值分別為25.270，22.179，19.759，15.779，P均<0.001)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組EB含量均降低(t值分別為3.381，4.912，6.948，P均<0.01)；與補陽還五湯組和血塞通組比較，聯合組EB含量均降低(t值分別為3.766，2.281，P均<0.05)，補陽還五湯組和血塞通組比較，差異無統計學意義(t=1.557，P>0.05)。

2.5 各組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表達量比較 與假手術組比較，MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織Wnt3a、β-catenin、AQP-4 mRNA相對表達量均升高，Claudin-5 mRNA相對表達量均降低(P<0.05)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織Wnt3a、β-catenin、Claudin-5 mRNA相對表達量升高，且聯合組高于補陽還五湯組和血塞通組(P<0.05)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織AQP-4 mRNA相對表達量均降低，且聯合組低于補陽還五湯組和血塞通組(P<0.05)。補陽還五湯組和血塞通組Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA相對表達量比較(±s)

2.6 各組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5蛋白表達量比較 與假手術組比較，MCAO組、補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織Wnt3a、β-catenin、Claudin-5蛋白相對表達量升高，AQP-4蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織Wnt3a、β-catenin、Claudin-5蛋白相對表達量升高，且聯合組高于補陽還五湯組和血塞通組(P<0.05)；與MCAO組比較，補陽還五湯組、血塞通組及聯合組腦組織AQP-4蛋白相對表達量降低，且聯合組低于補陽還五湯組和血塞通組(P<0.05)。補陽還五湯組和血塞通組Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖1。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與MCAO組比較，# P<0.05；與補陽還五湯組比較，△ P<0.05；與血塞通組比較，▲ P<0.05。

3 討 論

隨著我國老齡化加劇，缺血性腦卒中發病率逐年升高，已成為危害人們生命安全的主要疾病之一。缺血性腦卒中發病原因多種多樣，包括高齡、高血壓、高脂血癥等均是導致其發病的高危因素[9-10]。缺血性腦卒中發病機制十分復雜，多種因素導致頸動脈粥樣硬化斑塊形成，易損性斑塊進入大腦中動脈后導致腦組織血流供應不足，進而引起缺血缺氧性腦損傷[11-12]。血腦屏障的完整性是保持腦內環境穩定、維持中樞神經系統正常運行的基本結構，腦缺血后，血腦屏障主要結構毛細血管內皮及細胞間緊密連接、神經膠質膜等結構破壞，鈉泵功能障礙，血腦屏障通透性急速增加，引起體液外漏，繼發形成腦水腫[13-15]。因此，減輕血腦屏障通透性破壞對保護腦組織、促進神經功能改善有重要臨床意義。

本研究應用補陽還五湯干預MCAO大鼠后，其神經功能評分降低，貼紙去除時間縮短，EB含量、血清S-100β、NSE水平均降低，且神經功能評分、貼紙去除時間及血清S-100β、NSE水平與西藥血塞通比較差異無統計學意義，兩者聯合干預后改善更為明顯，說明補陽還五湯可有效減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷，降低血腦屏障通透性。現代中醫學認為，腦卒中后氣血逆亂，氣虛血滯，致腦絡瘀阻，氣化停滯，脈中津液不能正常運化，水瘀互結而腦竅閉塞，水溢于腦[16]。王清任認為，本病本虛標實，氣虛為本，血瘀為標，因虛致瘀是其致病機制，治療本病以補氣為主，活血通絡為主要原則，與現代中醫學治療缺血性腦卒中思路一致[17]。補陽還五湯以黃芪為君藥，大補元氣，使氣血旺以治本；以當歸尾為臣藥，活血祛瘀，使脈絡通以治標；另以赤芍、川芎、桃紅、紅花為佐藥，強化活血祛瘀功效，地龍為佐藥，通經活絡，使周身脈絡通暢，強化藥力[18]。補陽還五湯重補氣輔活血，標本兼顧，諸癥向愈。張文敏等[19]研究表明，補陽還五湯輔助治療急性腦梗死病人效果顯著，可有效改善病人神經功能，提高生活質量，安全可靠，說明補陽還五湯輔助治療急性期缺血性腦卒中效果確切。此外，陳旭寧等[20]應用超微補陽還五湯可有效改善恢復期缺血性腦卒中病人神經功能及生活質量，且抑郁癥狀得到緩解。林巧等[21]研究發現補陽還五湯可輔助治療Ⅱ型精神分裂癥，升高血清腦源性神經營養因子，說明補陽還五湯可促進腦神經功能恢復。本研究依據補陽還五湯組方各味中藥功能及配伍特點，重補氣促進腦絡運化，輔以活血祛瘀促進腦竅通暢，血利則水通，使血腦屏障作用得以恢復。

此外，本研究顯示，補陽還五湯組大鼠腦組織中Wnt3a、β-catenin及緊密連接蛋白Claudin-5表達增加，而腦組織水通道蛋白AQP-4表達降低，且上述指標表達與血塞通差異無統計學意義，兩者聯合干預后Wnt3a、β-catenin、Claudin-5增加及AQP-4降低更為明顯，說明補陽還五湯可能通過激活Wnt3a/β-catenin信號通路、上調Claudin-5、下調AQP-4表達發揮調控作用。Wnt/β-catenin信號通路是中樞神經系統發育及神經元細胞增殖、分化的重要調控通路。已有研究證實，腦血管內皮細胞中Wnt/β-catenin信號通路異常對血腦屏障功能及腦血管發育有重要影響，但對其他部位血管發育及功能無明顯影響[22-23]。Wnt3a是Wnt信號通路主要配體，通過與細胞膜特異性受體結合后，將信號傳至β-catenin，β-catenin進入細胞核后啟動下游靶基因轉錄、翻譯等過程[24]。缺血缺氧腦損傷后激活Wnt信號通路，參與缺血缺氧條件的血管新生，修復受損腦組織，從而改善血腦屏障結構和功能[25]。Laksitorini等[26]研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路活性增強有助于維持血腦屏障通透性，與本研究結果相符。本研究應用補陽還五湯干預后，Wnt/β-catenin信號通路激活，信號通路相關蛋白表達上調，且緊密連接蛋白Claudin-5上調及水通道蛋白AQP-4下調，均有助于腦組織損傷的修復，說明補陽還五湯可通過Wnt/β-catenin信號通路促進缺血性腦卒中腦組織修復，進一步提示該信號通路可能是補陽還五湯的靶點通路，可為臨床靶向治療提供新的思路。

綜上所述，補陽還五湯可有效減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷，推測可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調緊密連接蛋白Claudin-5、下調水通道蛋白AQP-4表達，減輕血腦屏障的破壞，達到保護腦組織的作用。本研究新穎之處在于采用動物試驗探討補陽還五湯減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷的可能機制，可為臨床應用補陽還五湯治療缺血性腦卒中提供理論基礎。由于研究時間及經費有限，補陽還五湯是否通過其他信號通路減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷，仍需要進一步研究證實。在進一步的研究中應開展多通路研究，以證實補陽還五湯多靶點作用的特點，為其應用于臨床治療缺血性腦卒中提供更為堅實的基礎。