活血通絡方調控Rho/ROCK通路對腦卒中大鼠肢體運動功能恢復的影響

張 波，義 艷，王 永，蔣 科

腦卒中恢復期多遺留肢體運動功能障礙[1]。積極改善肢體運動功能障礙是腦卒中恢復治療的重要任務，也是當代神經醫學亟待解決的關鍵問題[2]。腦卒中屬中醫“中風病”范疇，且中醫藥在腦卒中康復治療方面，有其悠久歷史[3]。活血通絡方以補陽還五湯為基礎，并加用息風止痙、溫經通絡藥物組合而成，臨床報道發現，其有利于腦卒中后遺癥病人肢體、語言、神經等功能恢復[4]。但其促進功能恢復的具體機制還不甚明確。目前，研究發現，腦卒中后遺肢體運動功能恢復，與運動沖動傳導、調節有關的傳導束-皮質脊髓束神經再生、修復及重塑關系密切[5]。肉瘤同源基因A(RhoA)/Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)通路是神經生長抑制及神經軸突生長潰變的關鍵通路，且已逐漸成為治療中樞神經損傷的新靶點[6]。活血通絡方能否通過調控RhoA/ROCK通路，調節皮質脊髓束重塑，影響前肢功能恢復的相關報道較少。本研究建立大鼠腦卒中模型，對此進行驗證，以期闡明活血通絡方改善腦卒中后遺癥病人肢體功能恢復的可能機制，并為其開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔健康Wistar雄性大鼠120只，7～8周齡，體質量280～300 g，購自福州海王福藥制藥有限公司，生產及使用許可證號分別為SCXK(閩)2020-0001及SYXK(閩)2020-0006。本院動物房中常規適應性飼養1周。本實驗經本院動物倫理委員會批準同意，符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 活血通絡方(延胡索20 g，丹參20 g，木瓜16 g，地風20 g，千年健20 g，雞血藤20 g，黨參15 g，川芎10 g，當歸10 g，白芷15 g，紅花15 g，桃仁10 g，桑葉15 g，土鱉蟲10 g等)中諸藥均購自張仲景大藥房，將方中諸藥加蒸餾水常規煎煮后過濾，取濾液濃縮至含生藥濃度為0.868 g/mL的濃縮液備用。生物素化葡聚糖胺(BDA)試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：OR97402)；生長相關蛋白(GAP-43)、RhoA、ROCK2、髓鞘相關阻斷因子(Nogo-A)、髓鞘相關糖蛋白(MAG)等抗體均購自美國abcam公司，貨號：ab75810、ab187027、ab125025、ab62024、ab277524；Axio Imager 2光學顯微鏡(北京普瑞賽司儀器有限公司)；JS-1070P/Mini化學發光成像儀(上海向帆儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦卒中模型建立及分組給藥 參照文獻[7]用右側大腦中動脈阻塞術制備腦卒中模型，術后1周，若大鼠出現向左側轉圈或傾倒、左前肢屈曲及行走困難現象，視為造模成功。共造模成功100只，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、活血通絡方低劑量組(8.68 g/kg)、活血通絡方高劑量組(34.72 g/kg)、LPA組(RhoA激動劑，5 nmol/kg)、活血通絡方+LPA(活血通絡方34.72 g/kg+LPA 5 nmol/kg)，每組20只。另取20只大鼠，只暴露右側中動脈，不進行結扎，其余方法同模型組，作為假手術組。各組大鼠均于造模成功后開始給藥，活血通絡方按人與動物等效劑量的1倍、4倍設置低、高劑量組，并制備成含生藥濃度為0.868 g/mL、3.472 g/mL的混懸液，按10 mL/kg的體積灌胃給藥；LPA參照文獻[8]設置劑量，用生理鹽水稀釋成濃度為50 μmol/L的混懸液，按0.1 mL/kg的體積，用腦立體定向儀于前囟中點后左側3.5 mm、4.5 mm處注入LPA溶液各約25 μL；活血通絡方+LPA組灌胃給予活血通絡方溶液的同時，用腦立體定向儀定向注入LPA溶液；模型組及假手術組灌胃給予等量生理鹽水并用腦立體定向儀于相同部位注入等量生理鹽水；活血通絡方給藥每日2次，LPA給藥每周1次，各組連續給藥4周。

1.2.2 足失誤試驗及走橫木試驗評價大鼠給藥前后肢體運動功能協調狀況 于大鼠給藥前(術后1周后)及給藥結束后(術后5周后)，分別對大鼠進行足失誤試驗及走橫木試驗。足失誤試驗參照文獻[9]用直徑1.5 mm的鐵絲制作網格邊長為2.5 cm，面積為45 cm×30 cm，高2.5 cm的網格平臺，記錄大鼠在網格平臺上掉落網格中的次數(失足次數)，足失誤比率=失足次數/前肢行走總步數×100%，足失誤比率越高，其前肢運動協調能力越差。橫木行走試驗參照文獻[10]將大鼠放置于長120 cm、寬2 cm、厚1 cm、高于地面80 cm的水平懸空橫木上，觀察大鼠在橫木上行走狀況，并進行評分，總分為6分，其評分越低，預示后肢運動功能越差。

1.2.3 生物素化葡聚糖胺(BDA)法檢測大鼠頸髓組織中皮質脊髓束陽性纖維表達變化 各組大鼠于術后4周(給藥結束前1周后)，隨機取10只，參照文獻[11]用腦立體定向儀于大鼠前囟中點后1 mm、2 mm及左側旁開3.5 mm、4.5 mm處共4個部位注射10% BDA溶液0.2 μL，1周后麻醉處死，取左右兩側C4～C6節段約4 cm頸髓組織，4%多聚甲醛固定24 h，不同濃度梯度蔗糖溶液脫水，冰凍包埋劑(OCT)包埋后，切成厚度為40μm的連續冠狀冰凍切片。取冰凍切片，用0.5%過氧化氫溶液抗原滅活15 min，0.3%曲拉通4 ℃透化6 h后，加入濃度為0.8 μg/L的辣根過氧化物酶(HRP)常溫孵育過夜，并用二氨基聯苯胺(DAB)顯色、中性樹脂封片后，置于顯微鏡下觀察BDA陽性表達的平均光密度值。

1.2.4 免疫熒光法檢測大鼠頸髓組織中皮質脊髓束GAP-43陽性表達水平 各組剩余10只大鼠給藥結束后，麻醉處死，取左右兩側C4～C6節段約4 cm頸髓組織，左側頸髓組織剪取0.5 cm后置于-80 ℃冰箱保存備用。剩余兩側頸髓組織置于4%多聚甲醛24 h，然后蔗糖梯度脫水，恒冷箱切片，約20 μm厚，磷酸鹽緩沖液沖洗及0.25%曲拉通透化，加入一抗(GAP-43，1∶800)4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗(羊抗兔FTTc，1∶500)室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液再次沖洗，置于載玻片上并加熒光封片劑封片，每片隨機取5個視野，在激光共聚焦顯微鏡下采集圖像，用Image Pro Plus 5.0系統分析圖像陽性表達的平均光密度值。

1.2.5 蛋白質免疫印跡(Western Blot)法檢測左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表達 取1.2.4中-80 ℃保存的左側頸髓組織，4 ℃解凍、組織勻漿器勻漿、裂解液裂解、離心提取蛋白，雙辛可寧酸(BCA)法測蛋白總濃度。取100 μg蛋白上樣、電泳、轉膜反應，加入一抗RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG(1∶800)，內參β-actin(1∶3 000)4 ℃孵育過夜，加入HRP羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育3 h，增強化學發光法顯色，以化學發光成像儀觀察條帶并拍照，以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

2 結 果

2.1 活血通絡方對大鼠肢體運動能的影響 腦卒中術后1周(治療前)，與假手組相比，模型組及各給藥組足失誤比率升高(P<0.05)，走橫木評分較術后1周降低(P<0.05)，提示大鼠出現肢體運動功能障礙。術后5周(給藥后)，模型組足失誤比率較術后1周降低(P<0.05)，走橫木評分較術后1周升高(P<0.05)，預示腦卒中大鼠肢體運動功能存在自發恢復現象。活血通絡方低劑量組、高劑量組大鼠給藥結束后，足失誤比率較術后1周降低(P<0.05)，走橫木評分較術后1周升高(P<0.05)，且上述指標改善效果越好，肢體運動功能恢復越好。術后5周，LPA組大鼠足失誤比率及走橫木評分較術后1周無明顯變化(P>0.05)，其肢體運動功能障礙比模型組嚴重(P<0.05)。術后5周，活化通絡方+LPA可逆轉活血通絡方高劑量組上述作用(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠足失誤比率及走橫木評分比較(±s)

2.2 活血通絡方對大鼠頸髓組織BDA陽性表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠左側及右側頸髓組織BDA陽性表達均降低(P<0.05)；與模型組相比，活血通絡方低劑量組、高劑量組大鼠左側頸髓組織BDA陽性表達降低(P<0.05)，右側頸髓組織BDA陽性表達升高(P<0.05)，且劑量越高變化越明顯(P<0.05)；LPA組左側頸髓組織BDA陽性表達較模型組、活血通絡方低劑量組、活血通絡方高劑量組升高(P<0.05)，右側頸髓組織BDA陽性表達較模型組、活血通絡方低劑量組、活血通絡方高劑量組降低(P<0.05)。活血通絡方+LPA可逆轉活血通絡方高劑量組上述作用(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠給藥結束后BDA陽性表達染色圖(×400)

表2 各組大鼠頸髓組織BDA陽性表達比較(±s)

2.3 活血通絡方對大鼠頸髓組織GAP-43陽性表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠左側及右側頸髓組織GAP-43陽性表達均降低(P<0.05)；與模型組相比，活血通絡方低劑量組、高劑量組大鼠左側頸髓組織GAP-43陽性表達較模型組、活化通絡方低劑量組、活血通絡方高劑量組降低(P<0.05)，右側頸髓組織GAP-43陽性表達升高(P<0.05)，且劑量越高變化越明顯(P<0.05)；LPA組左側頸髓組織GAP-43陽性表達較模型組、活化通絡方低劑量組、活血通絡方高劑量組升高(P<0.05)，右側頸髓組織GAP-43陽性表達較模型組、活化通絡方低劑量組、活血通絡方高劑量組降低(P<0.05)。活血通絡方+LPA可逆轉活血通絡方高劑量組上述作用(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 各組大鼠給藥結束后GAP-43免疫熒光圖(×400)

表3 各組大鼠頸髓組織GAP-43陽性表達比較(±s)

2.4 活血通絡方對大鼠左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表達的影響 與假手術相比，模型組大鼠左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比，活血通絡方低劑量組、高劑量組大鼠左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表達進一步降低(P<0.05)，且活血通絡方劑量越高蛋白表達降低越明顯(P<0.05)。LPA組大鼠左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表達較模型組、活血通絡方低劑量組、活血通絡方高劑量組升高(P<0.05)。活血通絡方+LPA可逆轉活血通絡方高劑量組上述作用(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白免疫印跡圖

表4 各組大鼠左側頸髓組織RhoA、ROCK2、Nogo-A、MAG蛋白表達水平比較(±s)

3 討 論

腦卒中病人多發生肢體、語言、認知等功能障礙，其中，肢體運動功能障礙是腦卒中恢復期最常見的并發癥，其給家庭及社會帶來沉重負擔的同時，也給病人帶來巨大打擊[12]。本研究用腦中動脈阻塞法制備大鼠腦卒中模型后發現，大鼠前肢足失誤比率均升高，預示大鼠出現肢體運動功能障礙，提示造模成功。中醫認為“腦主運動”“腦為髓海”，髓海不足是引起腦卒中恢復期癥狀纏綿難愈的重要原因，用活血、補氣、通絡法來生精益髓、滋養腦絡，可改善腦卒中后半身不遂、肢體麻木、癱瘓癥狀[13]。活血通絡方中延胡索、地風、千年健可活血通經絡，黨參、當歸等可補益氣血，丹參、雞血藤可促進麻痹神經恢復，對麻木癱瘓病人有較好的療效[4，14]。李峰等[15]發現活血通絡方對腦卒中后肢體運動功能障礙有較好的改善作用。本研究發現，大鼠前肢足失誤比率隨活血通絡方劑量的升高而降低，進一步證實活血通絡方可能為改善腦卒中后肢體運動功能障礙的潛在藥物，但其具體機制還需進一步探究。

皮質脊髓束是重要的運動神經元，與高度技巧性的隨意運動調節及傳導有關，是溝通腦和脊髓、支配隨意運動的關鍵神經傳導束[16]。中樞神經軸突所處的抑制環境(如Nogo-A、MAG等神經抑制因子的分泌)及中樞神經細胞的低再生能力等因素，使得皮質脊髓束損傷后再生困難，也使得腦卒中后遺功能障礙恢復困難[17]。而未損傷側皮質脊髓束重塑，可以代償性地促進運動功能恢復，即皮質脊髓束損傷后異常路徑恢復，越來越受到臨床研究者的關注[18]。劉維等[11，19]研究發現，腦卒中發生后未損傷側大腦皮質脊髓束可進行側支發芽，并跨越中線至對側未損傷區進行雙側支配，而促進肢體運動功能恢復作用，提示皮質脊髓束異常路徑重塑，可能在腦卒中運動功能恢復過程中發揮重要作用。BDA及GAP-43為神經纖維及軸突生長失蹤器，其表達的升高，預示神經纖維及軸突的再生長。劉維等[11]發現腦卒中后2周，大鼠腦梗死對側頸髓BDA及GAP-43表達無變化，而梗死側BDA及GAP-43表達升高，并推測腦梗死側頸髓中的陽性纖維，可能是由腦梗死對側脊髓束纖維芽生長及跨越延伸而生成。本研究發現，模型組大鼠腦卒中術后5周末，損傷側與未損傷側皮質脊髓束纖維BDA及GAP-43陽性表達均降低，大鼠肢體運動功能較1周前有所恢復，提示模型大鼠未損傷側皮質脊髓束可能自發重塑，并跨越至對側損傷側支配運動功能調節，從而促進肢體運動功能恢復，這與Jang等[18-19]研究提出的皮質脊髓束異常路徑重塑促進肢體運動功能恢復的機制相一致。活血通絡方劑量越高，大鼠未損傷側BDA及GAP-43陽性表達越低，損傷側BDA及GAP-43陽性表達越高，大鼠肢體運動功能恢復越明顯，提示活血通絡方發揮促進肢體恢復作用可能與促進皮質脊髓束異常路徑重塑有關。

RhoA可表達于神經元內，ROCK2是髓鞘抑制性信號的主要效應分子，RhoA可與神經再生抑制因子-Nogo-A受體結合，特異性刺激下游ROCK2通路，并調控神經抑制因子Nogo-A、MAG表達，發揮神經生長抑制和生長錐潰變作用，阻斷RhoA-ROCK2信號通路，可解除神經生長負性調控因子(如Nogo-A、MAG)表達，發揮促神經纖維及軸突生長及重構作用[20]。本研究發現，模型組大鼠未損傷側頸髓組織中RhoA及ROCK2蛋白表達及其調控的神經再生抑制因子相關蛋白Nogo-A、MAG表達均明顯低于假手術組，用RhoA激活劑激活大鼠未損傷側頸髓組織中RhoA-ROCK2信號通路及Nogo-A、MAG表達后，未損傷側BDA及GAP-43陽性表達與假手術組相近的同時，損傷側未見BDA及GAP-43陽性表達的纖維新生，大鼠肢體運動功能恢復最弱，提示未損傷側頸髓組織中RhoA/ROCK表達抑制，可能參與腦卒中后未損傷側皮質脊髓束自發異常路徑重塑促肢體運動功能修復過程。活血通絡方劑量越高，RhoA-ROCK2信號通路及其Nogo-A、MAG蛋白表達越低，提示活血通絡方促進腦卒中皮質脊髓束異常路徑重塑促肢體運動功能修復作用，可能與抑制未損傷側皮質脊髓束RhoA-ROCK2通路活化有關。而RhoA激活劑可逆轉活血通絡方上述作用。

綜上所述，活血通絡方可能通過抑制腦卒中未損傷側皮質脊髓束RhoA-ROCK2通路活化，促進皮質脊髓束異常路徑重塑，發揮促進肢體運動功能恢復的作用。但皮質脊髓束重塑及促肢體運動能恢復的調控網絡復雜，涉及多種途徑、多條調控機制，活血通絡方促進腦卒中肢體運動功能恢復的其他機制，還有待繼續深入探究。