絲素纖維基聚氨酯粘附涂層改性人工韌帶制備及性能測試分析

蔣 譽

(長安大學，陜西 西安 710064)

韌帶損傷是體育運動中較常見的情況。特別是籃球、足球等具有沖撞性的體育運動，稍不注意，就可能導致韌帶的挫傷、撕裂或斷裂，若不及時處理，就可能引發相關的骨關節炎癥，進而對運動員造成不可挽回的傷害。但受韌帶特殊生理結構的影響，韌帶受損后，自愈能力較低，因此在臨床治療的過程中，通常使用移植人工韌帶，幫助韌帶重建的方法。但傳統人工韌帶受其材料的影響，存在力學性能不足，降解速率較快，生物相容性較差的問題，使得人工韌帶的使用存在很多的局域性。為解決目前人工韌帶存在的問題，有學者研究了以納米材料為修飾材料制備人工韌帶的實用性，結果表明，納米材料修飾后，人工韌帶的粘附環境增加,促進細胞增殖，提供相對理想的力學強度[1]；但大部分納米材料皆不具備可降解性，對韌帶恢復造成一些影響。還有以絲素纖維為原材料，制作了可降解的仿生結構的人工韌帶，并用對材料表面進行低溫氧等離子體處理，增加了絲素纖維基人工韌帶的細胞相容性[2]；但絲素纖維基人工韌帶的力學性能無法滿足膝關節的日常所需，因此需要進一步對絲素纖維基人工韌帶進行改性?；诖?，本文文獻[2]的研究基礎上，以聚氨酯-納米羥基磷灰石為修飾材料，增強其力學性能，尋找一種適用于臨床的人工韌帶材料。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

主要材料：柞蠶絲(復絲),永發繭產品;碳酸鈉(AR)，恒業化工產品;納米羥基磷灰石(粒徑60～80 nm),星新型碳材料;二甲基甲酰胺(DMF，AR),輝安化工;聚氨酯(PU,CP)，廣源新材料科技。

主要設備：24錠高速編織機(GBG)，鴻源機械；HRD-818全自動繞紗機，南海榮鉅機械；AS-24常溫振蕩染色機，元茂儀器；AJL-1004超聲波清洗機，愛潔樂超聲波自動化設備；78-1恒溫磁力攪拌器，科瑞永興化玻儀器；CT-C電熱鼓風干燥箱，裕昌干燥工程；SQ-HZT-1003電子天平，順強機電設備；ZX500TR體式顯微鏡，眾尋光學儀器；YG004D醫用紡織品多功能強力儀，中纖檢測儀器設備；FD-1A-50冷凍干燥機，爭巧科學儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1絲素纖維基人工韌帶的成型

本文制備的絲素纖維基人工韌帶主要從仿生學角度考慮，以ACL結構為參照對人工韌帶進行設計。膠原纖維取向排列和ACL雙束結構分別通過編織結構和2條內芯與一層外殼結構進行模擬；具體編織過程：

(1)用HRD-818型全自動繞紗機在用于編織機錠子上卷繞柞蠶絲，共24個；

(2)將卷繞了柞蠶絲的錠子依次安裝在GBG型高速編織機上，編織2條“內芯”；

(3)將制作的2條內芯并列，置于編織機中央當芯紗，繼續編織“外殼”，得到編織人工韌帶，具體流程如圖1所示。

圖1 人工韌帶編織流程圖Fig.1 Flow chart of artificial ligament weaving

1.2.2人工韌帶的脫膠處理

(1)將制作的人工韌帶放入裝有濃度為5%的Na2CO3溶液的錐形瓶中，確保人工韌帶完全浸沒在溶液中。將錐形瓶放入AS-24型常溫振蕩染色機中進行振蕩脫膠處理，振蕩速率，脫膠溫度和時間分別為60 r/min、95 ℃和30 min；

(2)取出錐形瓶置于AJL-1004型超聲波清洗機內進行超聲清洗，清洗時間為10 min，倒掉Na2CO3溶液，在去離子水中超聲清洗20 min，取出人工韌帶進行搓洗，置于常溫條件下晾干。

1.2.3聚氨酯-納米羥基磷灰石復合涂層的制備

(1)在DMF中以質量分數10%溶入聚氨酯顆粒，置于78-1型恒溫磁力攪拌器上勻速攪拌，直至聚氨酯顆粒在溶液內分布均勻，攪拌速率為250 r/min；

(2)將少量DMF與納米羥基磷灰石混合，置于AJL-1004型超聲波清洗機中進行超聲分散，分散時間為15 min，得到均勻的納米羥基磷灰石分散液；

(3)用注射器將納米羥基磷灰石分散液緩慢滴加至聚氨酯溶液中，并在78-1型恒溫磁力攪拌器的作用下使之分散均勻，滴加速度和攪拌速度分別為0.1 mL/s和250 r/min，得到質量分數為15%的聚氨酯-納米羥基磷灰石分散液(N-Hap/PU)；

(4)將直徑為1.2 mm的不銹鋼芯棒襯入人工韌帶內，確保在涂層過程中其形狀不發生改變。在人工韌帶上用毛刷均勻涂覆聚氨酯-納米羥基磷灰石分散液，置于CT-C型電熱鼓風干燥箱中烘干，烘干溫度和時間分別為40 ℃和2 h；

(5)用SQ-HZT-1003型電子天平對烘干后人工韌帶進行稱重，記錄涂層前后人工韌帶質量變化，重復上述涂層烘干過程3次，得到聚氨酯-納米羥基磷灰石涂層人工韌帶(N-Hap/PU+SF)。具體制備流程如圖2所示。

圖2 聚氨酯-納米羥基磷灰石涂層制備流程圖 Fig.2 Preparation flow chart of polyurethane nano hydroxyapatite coating

1.3 性能測試

1.3.1表面觀察

用ZX500TR型體式顯微鏡觀察拍攝0～3次，觀察N-Hap/PU涂層人工韌帶表面差異，顯微鏡放大倍數為20。

1.3.2力學性能

(1)斷裂拉伸性能：用多功能強力儀對測試人工韌帶樣品的斷裂拉伸性，測試參數結果如表1所示。

表1 強力儀測試參數Tab.1 Test parameters of strength tester

斷裂強度表達式[3]：

(1)

式中:σ為斷裂強度；F為斷裂強力；S為樣品橫截面積。

楊氏模量表達式[4]：

(2)

式中:E為楊氏模量；ε為應變。

(2)彈性回復性能測試：用YG004D型醫用紡織品多功能強力儀對長度為5 cm樣品彈性回復率進行測定；按表1參數對樣品進行預處理，然后進行極限載荷下單次急彈性回復測試，測試條件如表2所示。

表2 單次急彈性回復測試條件Tab.2 Single rapid elastic recovery test conditions

彈性回復率表達式[5]：

(3)

式中:ER為彈性回復率；L為總伸長；L′為殘余伸長。

1.3.3細胞相容性

以SF織物(空白對照)、PU涂層和N-Hap/PU 涂層人工韌帶進行試驗。樣品表面細胞活性和增殖用CKK-8試劑盒評價，細胞數量表征是通過吸光度值對產物顏色的深淺進行量化。細胞銀光染色后，用顯微鏡觀察細胞形態，評價細胞在材料表面粘附生長情況。

1.3.4降解性能

將樣品置于降解液(此處為規定的無菌酶溶液)中進行降解試驗，每隔3 d更換一次降解液[6]。設置取樣點為0、14、28、56和84 d，去離子水沖洗3次樣品，吸干表面水分置于密封袋內，置于-20 ℃冷凍24 h；然后冷凍干燥24 h。

(1)質量損失率：用SQ-HZT-1003型電子天平稱量樣品初始質量，然后對樣品進行降解處理，在取樣點取出樣品后，置于恒溫恒濕環境24 h，稱取樣品降解后質量。

質量損失率表示式[7]：

(4)

式中：w0為初始質量；w1為降解后質量。

(2)降解液 pH值變化：用筆式pH計對每個取樣點降解液pH值變化進行測定和記錄。

2 結果與討論

2.1 涂層后人工韌帶材料的表面形態

在人工韌帶的使用過程中，需要對人工韌帶進行完整涂層，隔絕組織液與蠶絲，避免蠶絲快速降解。圖3為在人工韌帶上涂覆聚氨酯-納米羥基磷灰石分散液0～3次的體視顯微鏡照片。

圖3 人工韌帶顯微鏡照片 Fig.3 Micrograph of artificial ligament

從圖3可以看出，未經過涂層的人工韌帶，表面有較多的毛羽，這是蠶絲在編織過程中產生的。毛羽會增加人工韌帶與骨隧道的摩擦，對腱骨愈合產生一些不良的影響，經過一次涂層后，人工韌帶表面有聚氨酯附著，但整體涂層并不完整，孔洞和毛羽皆較為明顯。第2次涂層后，涂層完整度有所提升，但孔洞還是存在。3次涂層后，涂層較為完整，幾乎沒有孔洞出現，且毛羽較為服帖，滿足人工韌帶使用要求。

2.2 力學性能

理想的人工韌帶應與天然ACL生物力學性能相似，應在最小形變的條件下，產生較高的拉伸載荷。 圖4為人的ACL在拉伸載荷下的強力-伸長曲線。

圖4 ACL在拉伸載荷下的強力-伸長曲線Fig.4 Strength elongation curve of ACL under tensile load

從圖4可以看出，ACL曲線主要分為腳趾區、線性區和屈服區。腳趾區為較低應力條件下，韌帶內卷曲膠原蛋白纖維伸直。當膠原蛋白纖維完全伸直，繼續增加應力，韌帶開始進入線性區域，此時膠原蛋白發生滑移，單位應變內應力增加，進而增加了曲線斜率。應力繼續增加，在此應力作用下，膠原蛋白纖維逐漸破裂，此時應力降低，曲線斜率下降，韌帶也進入屈服區，直至全部膠原蛋白都發生斷裂。相關參考文獻表明，人的ACL極限拉力為600～2 300 N[8]。

2.2.1拉伸斷裂性能

圖5為人工韌帶斷裂強力-伸長曲線。

圖5 人工韌帶拉伸斷裂強力-伸長曲線Fig.5 Tensile breaking strength elongation curve of artificial ligament

從圖5可以看出，人工韌帶涂層前后均與人的ACL的三相曲線類似。涂層后人工韌帶斷裂強力有所上升，且應變減小，這就證明經過涂層后，人工韌帶材料的力學性能有所上升，且在較小變形條件下，承擔更大的應力。這是因為編織人工韌帶時，內部紗線交錯排列，在軸向壓力的作用下，編織角度縮小，用更多的紗線承擔軸向壓力，此時人工韌帶整體伸長，由較大應變產生。經過涂層處理后，涂層完全包裹紗線，且紗線間孔隙被涂層填滿，受軸向壓力時，紗線間幾乎不產生相對滑移，減小了應變作用。引入涂層材料對整體強力的提升產生積極的作用，增加了人工韌帶的整體斷裂強度。經過涂層后的人工韌帶的斷裂強度約為63.54 MPa，楊氏模量約為127.4 MPa，明顯高于人的ACL，這就說明經過涂層后的人工韌帶可為膝關節日?；顒犹峁┝W支撐；同時可在單位應變內提供較大應力，在較小形變的條件下，提供較高的機械強力[9]。

2.2.2彈性回復性能

圖6為涂層后人工韌帶的單次加載-卸載循環曲線。

圖6 涂層后人工韌帶的單次加載-卸載循環曲線Fig.6 Single loading unloading cycle curve of coated posterior artificial ligament

從圖6可以看出，涂層后人工韌帶彈性回復率為77.55%。回縮變形能力明顯優于傳統人工韌帶，使其在植入人體后，遇較大外力使得膝關節彎曲。讓韌帶伸長，能夠隨膝關節伸直回復到原來的長度，進而維持了膝關節的穩定性。

2.3 生物細胞相容性

圖7為不同樣品的 CCK-8測試結果。

圖7 不同樣品的 CCK-8測試結果Fig.7 CCK-8 test results of different samples

從圖7可以看出，同一培養時間條件下，各試件顯著性差異不大。在培養初期，僅用PU涂層的人工韌帶表面細胞數量相對較多，這是因為PU涂層表面較為光滑平整，對細胞粘附鋪展產生積極的作用。在4、7 d，N-Hap/PU涂層細胞相容性更佳，這可能是因為釋放出部分N-Hap粒子，促進了細胞的粘附和增殖。

圖8為材料表面粘附細胞的熒光染色照片。

圖8 樣品表面粘附細胞的熒光染色照片Fig.8 Fluorescent staining photos of adherent cells on the sample surface

從圖8可以看出，培養7 d后，2種材料表面細胞皆相對較多；但N-Hap/PU復合涂層人工韌帶表面的細胞數量和亮度皆高于PU涂層人工韌帶，這就證明經過N-Hap/PU復合涂層后，細胞生長情況更好，活性更好。同時形狀也慢慢由橢圓形轉變成連接較為緊密的梭形，這就證明N-Hap對細胞在材料表面的增殖和粘附起積極作用。

2.4 體外降解性能

2.4.1質量損失率

圖9為降解試驗中質量損失率曲線。

圖9 質量損失率變化曲線Fig.9 Variation curve of mass loss rate

從圖9可以看出，在試驗開始7 d，樣品有質量損失；在14～42 d，變化趨勢為先大幅度上升，然后慢慢的趨于平衡；這可能是因為N-Hap降解導致的。在降解早期，僅有少數N-Hap暴露在樣品表面，隨降解過程的進行，部分聚氨酯也隨之降解，使得更多N-Hap顆粒剝落，促使樣品質量降解率大幅度上升；在降解中后期，N-Hap顆粒幾乎完全剝落，聚氨酯降解較慢，此時，質量損失率曲線逐漸趨于平衡。當降解時間達到84 d后，質量損失率為8.2%。相關研究表明，在同等條件下，SF人工韌帶70 d質量損失率為18.6%[10]。這證實涂層的存在可調控人工韌帶的降解周期。

2.4.2降解液酸堿度變化

圖10為降解率pH值變化曲線。

圖10 降解液pH值變化Fig.10 pH change of degradation solution

從圖10可以看出，降解14 d前，pH值明顯下降，這是因為聚氨酯和絲素纖維降解過程中，產生了酸性產物氨基酸和小分子聚酯，使得降解液pH值有所下降；14 d后，降解液pH值有所上升，這是堿性N-Hap顆粒引起的；42 d后，整體pH值基本維持在7.0，這是因為此時人工韌帶降解趨于平衡，酸性產物和堿性產物互相緩沖，讓整體環境趨于中性[16-20]。這就證明本文制備的人工韌帶在酶環境下，也能維持較為穩定和緩慢的降解速率。

3 結語

本文以絲素纖維為原材料，以ACL結構為參照，以聚氨酯-納米羥基磷灰石為增強材料制備了仿生型人工韌帶，并對人工韌帶性能進行了系統的研究。

(1)經過N-Hap/PU3次涂層后，絲素纖維基人工韌帶涂層完整，羽毛服帖，沒有孔洞出現，能有效減少人工韌帶與鍵骨的摩擦，滿足人工韌帶使用要求；

(2)經過涂層后，人工韌帶彈性回復率高達77.55%，斷裂強度為63.54 MPa，楊氏模量約為127.4 MPa，明顯高于人的ACL，具備較優的力學性能和回縮變形能力，能為膝關節提供力學支撐和穩定性；

(3)涂層后人工韌帶進入體內后，釋放出部分N-Hap粒子，促進了細胞的粘附和增殖，細胞形狀也轉變成連接較為緊密的梭形，具備較好的生物相容性；

(4)涂層可調控人工韌帶的降解周期。涂層后人工韌帶降解84 d后，質量損失率僅為8.2%。42 d后，人工韌帶降解趨于平衡，降解液pH值趨于中性，證明在酶環境下，人工韌帶可維持較為穩定和緩慢的降解速率。