AKT2 rs3730051、AKT2 rs969531基因多態性與廣西地區人群ANCA相關性血管炎的關聯性

李柔 薛超 黎偉 饒金蘭

(廣西醫科大學第二附屬醫院腎內科，廣西 南寧 530007)

原發性抗中性粒細胞胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)是一組以小血管壞死性炎性損傷和纖維素樣壞死為特征的自身免疫性疾病，可致腎臟、肺臟等全身多器官損害，現已成為較常見的自身免疫性疾病之一，疾病病情復雜多變，發病高峰在65～74歲，有數據統計約50%患者在治療緩解后的5年內仍復發〔1〕。AAV發病機制尚未完全闡明，目前已證實遺傳因素參與ANCA相關性血管炎的發病過程中〔2〕，同時環境、藥物、感染等可能是重要誘因共同導致AAV的發生。AKT又稱作蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， AKT參與多條細胞信號通路，其中最重要作為磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的核心下游分子在機體中發揮作用。PI3K-AKT信號通路廣泛存在細胞中，PI3K活化后催化AKT磷酸化，引起信號通路的級聯反應，進一步磷酸化糖原合成酶激酶(GSK)-3、叉頭框蛋白(Fox)Os、B細胞淋巴瘤-2(Bad)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)9、核轉錄因子(NF)-κB、哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)及P21 等多種蛋白，介導細胞生長、增殖、細胞周期調節及糖代謝調節等多種活動〔3〕。目前已有研究表示PI3K-AKT信號通路與腫瘤、自身免疫性疾病、腎臟相關疾病發生和病理進展密切相關〔4，5〕。筆者推測PI3K-AKT信號通路可能參與AAV發病及疾病發展過程中，AKT是PI3K下游的關鍵蛋白，其中AKT2作為同工酶之一，在腫瘤和糖尿病中發揮重要作用〔6,7〕。目前AKT2在ANCA相關性血管炎中遺傳學意義尚不明確，本研究旨在探討AKT2 rs3730051、rs969531基因多態性與廣西地區人群ANCA相關性血管炎的關聯性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2005年1月至2018年12月于廣西醫科大學第二附屬醫院住院及門診確診為AAV的215例患者為AAV組，其中男82例，女133例，平均年齡(54.44±14.9)歲。對照組收集同期于體檢中心體檢的性別、年齡相仿的健康人群201例，其中男79例，女122例，平均年齡(52.21±11.87)歲。兩組平均年齡(t=1.691)及性別構成(χ2=0.059)差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究對象籍貫均為廣西，本研究已獲得廣西醫科大學倫理委員會的批準及全體納入對象的知情同意。納入標準：參照2018年增編的2012年Chapel Hill國際血管炎命名會議的標準。排除標準：排除繼發性小血管炎及合并多器官功能障礙、腫瘤、其他自身免疫性疾病、妊娠的患者。

1.2資料收集 收集納入患者的一般資料、臨床資料、實驗室資料。一般資料包括：年齡、性別。臨床資料包括：血尿、發熱、咳嗽、水腫、皮疹、關節痛、肌肉痛、咯血、體重下降(≥5 kg/30 d)等癥狀。實驗室資料包括：血常規、尿常規、肝功能、腎功能、血脂四項、尿蛋白定量及定性、空腹血糖、自身抗體、ANCA抗體、C反應蛋白(CRP)、血沉、抗鏈球菌溶血素(ASO)、類風濕因子(RF)、補體、胸片、腎臟穿刺病理結果。

1.3外周血收集和基因組DNA提取 使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集所有研究對象外周靜脈血2 ml，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，嚴格按照說明書步驟提取外周血基因組DNA。

1.4基因分型 采用多重聚合酶鏈反應(PCR)擴增結合高通量測序方法，由生工生物工程(上海)有限公司完成基因分型。具體步驟：設計并合成好一個包含本研究中AKT2 rs3730051、rs969531位點的引物池，然后通過兩步PCR的方法完成目標單核苷酸多態性(SNP)位點序列的擴增和兼容Illumina測序文庫的制備。第一輪PCR體系如下：DNA 模板(10 ng/μl) 2 μl;上游引物池(10 μmol/L)1 μl;下游引物池(10 μmol/L) 1 μl;2×PCR Ready Mix 15 μl(總體積 25 μl)(Kapa HiFi Ready Mix)。配制好反應體系后，在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)上執行以下反應程序：98℃預變性3 min，然后執行8個循環，條件是98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s。緊接著執行25個循環，條件是98℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。最后72℃延伸5 min。反應完成后，4℃保存反應產物。PCR完成后，使用1%的瓊脂糖膠電泳檢測PCR產物，確定產物大小正確，使用AMPure XP磁珠純化回收PCR產物。然后以第一輪PCR產物為模板執行第二輪PCR反應，以獲得測序帶分子標簽的文庫。反應體系如下：DNA模板(10 ng/μl) 2 μl，通用P7引物(含分子標簽，10 μmol/L)1 μl;通用P5引物(10 μmol/L) 1 μl;2× PCR Ready Mix 15 μl(總體積30 μl)。配制好反應體系后，執行如下PCR程序：98℃預變性5 min，然后執行5個循環程序，變性94℃ 30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，最終72℃延伸5 min。完成后4℃保存反應產物。最終PCR產物使用AMPure XP磁珠純化回收。各個PCR產物等量混合后，使用HiSeq XTen測序儀(Illumina,San Diego,CA)進行測序。

1.5統計學分析 采用SPSS19.0軟件和SHEsis在線軟件進行獨立樣本t檢驗、方差分析、χ2檢驗和Logistic回歸分析。非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距表示，采用秩和檢驗。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗以P>0.05表示群體具有代表性。

2 結 果

2.1各SNP位點基因型及等位基因頻率的分析 兩組樣本在rs3730051、rs969531位點上基因型、等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明研究對象具有群體代表性。AAV組與對照組AKT2 rs3730051、rs969531基因型及等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2AAV組各基因型間臨床癥狀比較 在AAV組215例患者中采集到185例患者的臨床癥狀，根據體重下降、發熱、咳嗽、水腫、關節痛癥狀發生頻率，分別在各個位點的基因型間進行對比，發現rs3730051位點基因型頻率在AAV患者中伴體重下降和不伴體重下降亞組中分布差異有統計學意義(P<0.05)。在AAV組中，以rs3730051位點基因型為自變量，是否出現體重下降癥狀為因變量進行Logistic回歸分析，以CC+TC基因型為參照(OR=1)，發現攜帶TT基因型出現體重下降癥狀的風險是CC+TC基因型的3.043倍(OR=3.043，OR95%CI=1.43～6.45；P=0.003)。見表2、表3。

表1 AKT2 rs3730051、rs969531基因型和等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

表2 AAV組rs3730051、rs969531位點各基因型在臨床癥狀亞組的對比〔n(%)〕

2.3AAV組各基因型實驗室檢查比較 對AAV組中白細胞計數、中性粒細胞計數、三酰甘油、膽固醇、空腹血糖實驗室指標分別在各個位點的基因型間進行對比，發現rs3730051位點白細胞計數在AAV患者各基因型中分布差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 AAV組rs3730051、rs969531各基因型實驗室指標的對比〔M(P25，P75),n=215〕

3 討 論

AAV以多臟器受累為常見表現，自然病程死亡率高，預后差，影響預后的關鍵因素為早期診斷、早期及合理使用糖皮質激素和(或)免疫抑制劑治療。為提高AAV的診斷水平和治療效果，需盡快闡明其發病機制，爭取在病因水平上進行預防及治療。其中遺傳因素在AAV的發病機制中起重要作用，AKT2位于人類染色體的19q13.2，為AKT的一種重要亞型， AKT2影響細胞增殖，在早期囊胚增殖和胚胎發育中必不可少〔8〕。AKT2持續活化與腫瘤密切相關， AKT2在肺癌〔9〕、肝細胞癌〔10〕、結腸癌〔11〕、卵巢癌〔12〕、乳腺癌〔13〕等多種腫瘤組織有過度表達或活化，并與腫瘤增殖、侵襲、轉移及預后相關。在免疫系統中，AKT2參與體液反應，通過調節CD19磷酸化，促進B細胞受體(BCR)信號通路和肌動蛋白重塑，增強B細胞的活化〔14〕。目前B細胞抑制劑利妥昔單抗對AAV治療療效逐漸證實， AKT2可能通過影響B細胞活化參與AAV發病機制。AKT2可影響輔助性T細胞(Th)及調節性T細胞(iTreg)的分化及功能，AKT2可以促進Th-17亞群的分化及影響外周CD4 T細胞的功能〔15〕。Qiao等〔16〕發現AKT2通過Foxo1/Foxo3a依賴的方式參與抑制iTreg的生成。Ouyang等〔17〕發現敲除AKT2小鼠出現嚴重的自身免疫性腦脊髓炎，這與tTreg增殖缺陷和Th1/Th17反應升高有關。Th17/Treg失衡在AAV發病機制中扮演著重要角色。Abdulahad等〔18〕發現在AAV患者外周血中Th-17和白細胞介素(IL)-17A水平升高，并普遍存在以Th-17為主的Th細胞的異常分化，從而導致靶器官的損害〔19〕。在AAV患者活動期中檢測到Treg細胞數量減少、功能受損〔20〕，疾病進展可能與CD4 T細胞數量的增加相關。根據上述分析，AKT2可能參與通過T細胞免疫影響AAV發病及疾病進展。目前AKT2與AAV疾病的關聯性尚缺乏研究，因此推測AKT2 rs3730051、rs969531基因多態性是否與AAV的發生發展相關。本研究結果提示，所選擇的AKT2 rs3730051、rs969531位點可能與廣西人群AAV的遺傳易感性無關。目前關于該兩位點研究尚少，僅有單項研究發現AKT2 rs3730051與多囊卵巢綜合征發病相關〔21〕，一項國內小樣本研究發現AKT2 rs3730051突變能增加冠心病的發病率〔22〕。PI3K/AKT信號通路對免疫細胞的募集及活化的調控具有重要作用，已有研究提示在多種炎癥疾病如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、多發性硬化癥等疾病病程中發揮著重要作用〔4〕，但該通路的基因多態性與自身免疫性疾病關聯性研究甚少，需進一步探索。

本研究發現，AKT2 rs3730051位點攜帶TT基因型發生體重下降的風險較TC+CC基因型高。AKT2是維持正常葡萄糖穩態的重要基因，AKT2通過葡萄糖轉運蛋白(GLUT)及GSK等多種底物影響糖代謝。AKT2對胰島素抵抗和糖尿病發病起重要作用，研究證實缺乏AKT2基因的小鼠對胰島素有抵抗，同時胰島素抑制葡萄糖產生的能力被完全清除〔23〕。在嚴重胰島素抵抗的患者體內發現有AKT2基因的突變〔24〕。在脂質代謝中，PI3K/AKT通路通過抑制 Foxo1 的磷酸化而解除對過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ的活性抑制，從而促進成脂過程〔25〕。其中有研究表示干擾AKT2較干擾AKT1明顯抑制成脂分化過程，提示可能為AKT2參與上述過程〔26〕。筆者推測AKT2 rs3730051位點可能影響AKT的下游底物進而影響糖代謝、脂質代謝通路，造成機體代謝紊亂導致體重下降發生，但在本研究中對病例組中兩位點的各基因型總膽固醇、三酰甘油、血糖指標進行對比未見明顯差異，考慮可能與營養結構、疾病進展狀態程度不同，故該影響機制尚待進一步研究。

本研究對實驗室資料分析顯示，在AAV組rs3730051位點各基因型攜帶TT基因型的白細胞計數偏高。AKT2可調控巨噬細胞的極化影響炎癥反應，Wu等〔27〕發現在牙周炎患者中過表達AKT2可以誘導M1巨噬細胞極化，降低M2極化，還可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，進而增加促炎介質的釋放。小血管的炎性損傷是AAV的基本特征，筆者推測在rs3730051位點攜帶TT基因型時AKT2基因活性較高和功能較活躍，促進白細胞升高并影響巨噬細胞極化，促進炎癥反應的發生。但該亞組白細胞計數平均值在正常范圍內，該結果需辨證看待。

綜上，AKT2 rs3730051、rs969531基因多態性與廣西人群AAV遺傳易感性無關，AKT2 rs3730051基因多態性與AAV患者體重下降相關，AKT2 rs3730051基因多態性影響AAV患者的白細胞水平。但由于本研究樣本量較小和地域局限，目前對AKT2基因多態性研究尚少，上述結論需進一步擴大樣本量及進行多區域、多位點研究。