circ_POLA2靶向miR-330-5p對腦膠質(zhì)瘤細胞生長及轉移能力的影響

羅方接 張代龍 鄧景陽 陳亞德 曾志明 祝展鵬

(東莞市松山湖中心醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 東莞 523320)

腦膠質(zhì)瘤具有惡性程度高與侵襲性強等特點，患者5年生存率較低，目前腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚未闡明〔1,2〕。環(huán)狀RNA(circRNA)是由5′端與3′端以共價鍵形成的閉合環(huán)狀RNA分子，其不易被RNaseA降解且具有組織特異性、穩(wěn)定性等特點，已知circRNA在腦膠質(zhì)瘤中表達異常，并可充當微小RNA(miRNA)的海綿分子而負向調(diào)控miRNA的表達進而調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡等生物學行為〔3,4〕。circ_POLA2在肺癌細胞中表達上調(diào)，其可通過調(diào)控miR-326/GNB1軸而促進肺癌細胞增殖及轉移〔5〕。但circ_POLA2與腦膠質(zhì)瘤的相關報道研究相對較少。Circular RNA Interactome預測顯示circ_POLA2與miR-330-5p存在結合位點，研究表明miR-330-5p在腦膠質(zhì)瘤細胞中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制細胞增殖〔6〕。但circ_POLA2/miR-330-5p軸在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制尚未可知。本研究主要探討circ_POLA2是否可通過靶向調(diào)控miR-330-5p而影響腦膠質(zhì)瘤細胞生長及轉移。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 收集2019年1月至2020年5月東莞市松山湖中心醫(yī)院腦科手術切除的46例腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁組織標本，其中男26例，女20例，年齡50～68歲，平均(55.49±6.77)歲，所有患者為初次診治患者且經(jīng)手術病理證實為腦膠質(zhì)瘤，患者術前均為接受放化療治療。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情且簽署同意書。人腦膠質(zhì)瘤細胞T98G購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清購自美國Gibco；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；Trizol試劑、逆轉錄試劑與熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；circ_POLA2小分子干擾RNA(si-circ_POLA2)及陰性對照(si-NC)、miR-330-5p寡核苷酸模擬物(miR-330-5p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-330-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-330-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物；pcDNA、pcDNA-circ_POLA2購自廣州復能基因；CCK-8、基質(zhì)膠、Transwell小室購自北京索萊寶；葡萄糖消耗量購自北京普萊利基因；乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9單克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz。

1.2方法

1.2.1實驗分組 T98G細胞按照每孔1×104個細胞的密度接種于6孔板，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基分別稀釋轉染物：si-NC、si-circ_POLA2、miR-NC、miR-330-5p mimics、si-circ_POLA2與anti-miR-NC、si-circ_POLA2與anti-miR-330-5p，充分混勻后室溫孵育5 min，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000轉染試劑，分別將Lipofectamine2000稀釋液與轉染物稀釋液充分混勻室溫靜置20 min，將二者混合溶液按照每孔400 μl的密度加入6孔板，6 h后棄舊培養(yǎng)基并更換為DMEM新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別記為si-NC組、si-circ_POLA2組、miR-NC組、miR-330-5p組、si-circ_POLA2+anti-miR-NC組、si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p組。

1.2.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測circ_POLA2、miR-330-5p的表達水平 用Trizol試劑提取組織標本與T98G細胞總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，SYBR Green PCR試劑用于進行qRT-PCR，反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算circ_POLA2、miR-330-5p相對表達量。

1.2.3CCK-8實驗檢測細胞增殖 取各組T98G細胞(2×105個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h時加入20 μl CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值(OD)。

1.2.4檢測葡萄糖消耗量、乳酸生成量 收集各組T98G細胞培養(yǎng)基，用葡萄糖檢測試劑盒檢測葡萄糖濃度，葡萄糖消耗量=培養(yǎng)基本底葡萄糖濃度-實驗組培養(yǎng)基葡萄糖濃度；用乳酸檢測試劑盒檢測乳酸濃度，乳酸生成量=培養(yǎng)基本底乳酸濃度-實驗組培養(yǎng)基乳酸濃度。

1.2.5劃痕實驗 6孔板內(nèi)接種各組T98G細胞懸液(1×105個/孔)，用標記筆在6孔板后面劃橫線(間隔0.5～1.0 cm)，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用移液槍槍頭比對直尺垂直橫線劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞后加入不含血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)0 h與24 h取樣拍照〔劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%〕。

1.2.6Transwell實驗檢測侵襲 基質(zhì)膠稀釋液加入小室的上室(40 μl/孔)，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h后加入各組T98G細胞(1×104個/孔)，下室加入600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽除去膜表面殘留，PBS洗滌后用甲醇固定20 min，棄甲醇后加入0.1%結晶紫染色液染色20 min，于顯微鏡下觀察并拍照(取5個視野細胞數(shù)平均值)。

1.2.7熒光素酶報告基因實驗及RNA免疫沉淀(RIP)檢測circ_POLA2與miR-330-5p的靶向關系 根據(jù)psiCHECK2載體酶切位點設計合成野生型WT-circ_POLA2與突變型MUT-circ_POLA2并分別連接于psiCHECK2載體，擴增后提純，分別將WT-circ_POLA2、MUT-circ_POLA2與miR-NC、miR-330-5p mimics共轉染至T98G細胞，培養(yǎng)48 h后檢測細胞熒光素酶活性。RIP實驗：取T98G細胞加入RIPA裂解液裂解細胞，收集上清后加入800 μl NT-2緩沖液，依次分別加入Argonaute RISC催化組分(Ago)2抗體(20 μg)或免疫球蛋白(Ig)G抗體(20 μg)，同時取出10 μl樣品作為Input備份，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，抗體孵育3 h后離心10 min，冰上孵育1 min，棄上清，加入2×蛋白上樣緩沖液(10 μl)，沸水煮5 min，冰上孵育1 min，獲得沉淀即成為RIP沉淀，用qRT-PCR法檢測RIP沉淀中circ_POLA2與miR-330-5p的表達量。

1.2.8Western印跡檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達 收集各組T98G細胞加入細胞裂解液后于4℃搖床上孵育30 min，4℃條件下經(jīng)12 000 r/min轉速離心10 min，取上清液即為總蛋白，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液煮沸變性，按照每孔20 μl的密度加入上樣孔，目的蛋白分離后終止電泳，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)與GAPDH(1∶2 000)抗體溶液孵育PVDF膜過夜，次日，室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h，加入化學發(fā)光劑后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1circ_POLA2與miR-330-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及其相關性 與癌旁組織比較，腦膠質(zhì)瘤組織中circ_POLA2表達明顯升高，miR-330-5p的表達明顯降低(P<0.05)，見表1。circ_POLA2與miR-330-5p呈負相關(r=-0.896 4，P<0.001)。

2.2干擾circ_POLA2表達對T98G細胞增殖及糖酵解水平的影響 與si-NC組比較，si-circ_POLA2組細胞活力、葡萄糖消耗量和乳酸生成量明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 circ_POLA2與miR-330-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達

表2 干擾circ_POLA2表達對T98G細胞糖酵解水平的影響

2.3干擾circ_POLA2表達對T98G細胞遷移及侵襲的影響 與si-NC組比較，si-circ_POLA2組劃痕愈合率和MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低(P<0.05)，侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 Western印跡檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達

表3 干擾circ_POLA2表達對T98G細胞遷移及侵襲的影響

2.4circ_POLA2靶向調(diào)控miR-330-5p circ_POLA2與miR-330-5p存在結合位點，見圖2。miR-330-5p過表達可明顯降低野生型載體WT-circ_POLA2的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-circ_POLA2的熒光素酶活性，見表4。RIP實驗證實circ_POLA2可結合miR-330-5p，見表5。與pcDNA組(1.00±0.04)比較，pcDNA-circ_POLA2組miR-330-5p表達量明顯降低(0.38±0.04，P<0.05)；與si-NC組(1.00±0.05)比較，si-circ_POLA2組miR-330-5p表達量明顯升高(2.28±0.17，P<0.05)。

圖2 Circular RNA Interactome預測顯示circ_POLA2與miR-330-5p存在結合位點

表4 雙熒光素酶報告基因實驗結果

表5 RIP實驗結果

2.5miR-330-5p過表達對T98G細胞增殖、糖酵解水平、遷移及侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-330-5p組細胞活力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量、劃痕愈合率和MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低，24、72 h侵襲細胞數(shù)明顯減少(均P<0.001)，見表6、圖3。

表6 miR-330-5p過表達對T98G細胞糖酵解水平、遷移及侵襲的影響

圖3 miR-330-5p過表達對T98G細胞增殖及MMP-2、MMP-9蛋白表達量的影響

2.6抑制miR-330-5p表達部分逆轉干擾circ_POLA2對T98G細胞增殖、糖酵解水平、遷移及侵襲的抑制作用 與si-circ_POLA2+anti-miR-NC組比較，si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p組細胞活力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量、劃痕愈合率、MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯升高，侵襲細胞數(shù)明顯增多(均P<0.001)，見圖4、表7。

1，2：si-circ_POLA2+anti-miR-NC組,si-circ_POLA2+anti-miR-330-5p組圖4 抑制miR-330-5p表達部分逆轉干擾circ_POLA2對T98G細胞增殖及MMP-2、MMP-9蛋白表達量的作用

表7 抑制miR-330-5p表達部分逆轉干擾circ_POLA2對T98G細胞糖酵解水平、遷移及侵襲的抑制作用

3 討 論

circRNA屬于新型非編碼RNA分子，主要分為外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA等，其廣泛存在于機體內(nèi)，既往研究顯示circRNA在腦膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)或下調(diào)，并可能作為腦膠質(zhì)瘤診斷及治療的潛在靶點，例如，circ-SMAD7通過上調(diào)PCNA促進腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和轉移〔7〕。circSCAF11通過miR-421/SP1/VEGFA軸促進腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生〔8〕。CircZNF60/miR-134-5p/BTG-2軸可促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移〔9〕。circ-MAPK4通過充當miR-125a-3p的海綿分子而調(diào)控MAPK信號通路進而抑制腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡〔10〕。circ_0008225通過充當miR-890的海綿分子而促進ZMYND11表達進而抑制腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展〔11〕。

circ_POLA2在宮頸鱗狀細胞癌中呈高表達，其可通過調(diào)控miR-326/GNB1軸而促進宮頸鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移及侵襲〔12〕。但circ_POLA2在腦膠質(zhì)瘤中的表達及其可能作用機制尚未可知。本研究結果提示，干擾circ_POLA2表達抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖。有氧糖酵解主要是指在氧氣充足時腫瘤細胞葡萄糖代謝是以糖酵解為主，當葡萄糖轉變?yōu)槿樗岷罂僧a(chǎn)生三磷酸腺苷而滿足腫瘤細胞對能量的需求，糖酵解可為腫瘤細胞生物大分子合成提供物質(zhì)基礎，還可促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲，研究顯示有氧糖酵解是腦膠質(zhì)瘤細胞增殖及轉移的重要原因之一〔13〕。本研究結果提示，干擾circ_POLA2表達可能通過降低腦膠質(zhì)瘤細胞糖酵解水平而抑制細胞增殖進而抑制腦膠質(zhì)瘤發(fā)展進程。MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，其可降解細胞外基質(zhì)沉積而促進細胞轉移〔14〕。本研究結果提示，干擾circ_POLA2表達可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞遷移及侵襲。

本研究結果提示，circ_POLA2可能通過吸附miR-330-5p而參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程。研究表明miR-330-5p通過靶向ITGA5抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖和侵襲〔15〕。circ_0008532通過調(diào)節(jié)miR-155-5p/miR-330-5p/MTGR1軸促進膀胱癌的進展〔16〕。circSFMBT1通過靶向miR-330-5p/PAK1軸促進胰腺癌的生長和轉移〔17〕。circ_0025033通過調(diào)節(jié)miR-330-5p/KLK4軸促進卵巢癌的發(fā)展〔18〕。表明miR-330-5p在腫瘤中呈低表達，并可能發(fā)揮抑癌基因作用，同時miR-330-5p基因序列上含有多個circRNA的結合位點，即多個circRNA可能通過吸附miR-330-5p而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程。本研究結果提示circ_POLA2可通過靶向miR-330-5p而促進腦膠質(zhì)瘤細胞生長及轉移。