miR-187-3p調控FOXK1/NF-κB信號通路影響破骨細胞增殖、凋亡及分化的分子機制

張濤 楊扉扉 王藜篥 黃華 張松 曹永飛

(貴州省骨科醫(yī)院骨外科，貴州 貴陽 550002)

骨質疏松(OP)的主要特征為骨代謝增加、骨密度降低等，常發(fā)生于絕經后婦女中，已成為影響絕經后婦女生活質量的重要問題，大部分患者在骨折發(fā)生后被確診為OP，因而早期診斷及治療成為提高患者生活質量的重要途徑〔1,2〕。微小RNA(miRNA)廣泛存在于機體中表達異常與骨代謝異常密切相關，并可能作為診斷OP的重要輔助指標〔3〕。miR-187-3p表達水平升高可抑制大麻素受體2型(CNR2)對成骨細胞前體細胞成骨分化的抑制作用〔4〕。靶基因預測顯示miR-187-3p與叉頭框轉錄因子(FOX)K1存在結合位點，研究表明抑制FOXK1表達可通過抑制糖酵解作用而抑制肝癌細胞增殖〔5〕。原花青素通過抑制核因子(NF)-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路而抑制OP破骨細胞的形成和功能〔6〕。本研究探討miR-187-3p對破骨細胞增殖、凋亡、分化的影響及其對FOXK1/NF-κB信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1一般資料 選取貴州省骨科醫(yī)院2018年2月至2020年9月收治的49例絕經后OP性骨折患者為OP組，所有患者符合世界衛(wèi)生組織在2004年頒布的OP診斷標準，年齡63～75歲，平均(68.24±5.61)歲，體重(62.31±6.29)kg，身高(156.32±5.62)cm，體重指數(BMI，26.16±3.16)kg/m2。同時選取絕經后OP無骨折患者49例為control組，年齡65～78歲，平均(69.34±3.24)歲，體重(61.35±5.24)kg，身高(155.49±6.32)cm，BMI(26.35±3.21)kg/m2。兩組年齡、體重、身高、BMI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。所有研究對象于清晨抽取患者空腹外周靜脈血，室溫靜置5 min后經3 000 r/min轉速離心10 min，吸取上清液置于-20℃冰箱內保存。

1.1.2主要試劑 南京君科生物提供18只SPF級雌性大鼠，動物合格證號：SYXK(寧)：2016-0020，體重(184.16±23.16)g，8周齡。美國Invitrogen提供Lipofectamine2000、Trizol試劑；北京天根生化提供反轉錄與熒光定量PCR試劑；廣州銳博生物提供miR-NC、miR-187-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-187-3p；武漢淼靈生物提供pcDNA；北京索萊寶提供噻唑藍(MTT)試劑、細胞凋亡檢測試劑盒；美國CST提供兔抗鼠Ki-67、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3抗體；北京百奧萊博提供兔抗鼠p-p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IкBα)抗體。

1.2方法

1.2.1建立OP大鼠模型與分離大鼠破骨細胞 采用隨機分組的方法分為正常組與模型組，每組9只。模型組禁食12 h，肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛進行全身麻醉，消毒后在大鼠背部正中切口，切除大鼠肋緣下側的雙側卵巢，縫合切口后采用無菌紗布與油紗雙層敷料覆蓋創(chuàng)面、包扎，通過檢測大鼠的血、尿、骨骼參數判斷造模是否成功〔7〕。兩組頸椎脫位處死后，采用乙醇浸泡消毒，采取大鼠兩側股骨、脛骨，取周圍軟骨組織后切除兩端骨骺，骨髓腔暴露，采用50 ml α-MEM培養(yǎng)液與1 ml青霉素-鏈霉素溶液清洗骨髓腔直至骨面變白，輕輕吹打提取液，細胞計數，經25 000 r/min離心8 min后，加入10 ml α-MEM培養(yǎng)液制備單細胞懸液〔8〕。

1.2.2實驗分組 在10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中接種破骨細胞，使細胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一直到細胞能生長融合達到80%，之后開展傳代培養(yǎng)。于96孔板(100 μl/孔)接種對數生長期破骨細胞(2.5×105個/ml)，分別將miR-NC、miR-187-3p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-FOXK1、miR-187-3p mimics與pcDNA-NC、miR-187-3p mimics與pcDNA-FOXK1轉染入破骨細胞，分別記為miR-NC組、miR-187-3p組、pcDNA-NC組、pcDNA-FOXK1組、miR-187-3p+pcDNA-NC組、miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為NC組。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-187-3p與FOXK1、耐酒石酸酸性磷酸酶(Acp)-5、基質金屬蛋白酶(MMP)9、組織蛋白酶(Cathepsin)K、整合素(Integrinαv)mRNA 的表達水平 針對control組、OP組的血清、各種破骨細胞總RNA均經過Trizol法提取，以反轉錄方法合成cRNA，并開展qRT-PCR擴增。之后進行熒光定量PCR方法對基因的相對表達量作出檢測。

1.2.4MTT檢測細胞增殖 將各組的破骨細胞接種在96孔板上，并且在每孔中均加入20 μl MTT溶液，然后放置在體積分數為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱當中，設置溫度為37℃，持續(xù)培養(yǎng)4 h，取上清液，之后每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在溫室作用之下震蕩孵育5 min，再以酶標儀將各孔的吸光度值做出標準檢測。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 每組的破骨細胞內均需要將胰蛋白酶(0.25%濃度)加入促進消化，以凋亡測試試劑盒的說明書為依據進行嚴格的檢測。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測miR-187-3p與FOXK1的靶向關系 將miR-NC、miR-187-3p mimics分別同野生型載體WT-FOXK1與突變型載體MUT-FOXK1共同轉入到破骨細胞，之后常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后開展熒光測試，利用熒光素酶活性對細胞進行測定，分析結果。

1.2.7Western印跡檢測FOXK1、Ki-67、Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IкBα蛋白表達 所有組的破骨細胞均以500 μl的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液實施細胞提取，得到細胞總蛋白，將所獲取的細胞總蛋白樣品選擇50 μl加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)開展電泳反映，使蛋白分離。之后在密閉環(huán)境下停放2 h，將1∶1 000的一抗稀釋液加入，將輔浴箱溫度設置為4℃，放入其中孵育24 h。對經過TBST洗滌以后的樣品再加入1∶2 000的二抗稀釋液,然后采用ImageJ軟件為各個條帶灰度值作出分析。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1OP性骨折患者血清中miR-187-3p和FOXK1的表達水平 與control組比較，OP組血清中miR-187-3p表達水平明顯降低，FOXK1 mRNA及蛋白水平明顯升高(均P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測人血清中FOXK1蛋白表達

表1 OP骨折患者血清中miR-187-3p和FOXK1表達水平

2.2OP大鼠模型破骨細胞中miR-187-3p和FOXK1表達情況 與正常組比較，模型組miR-187-3p表達水平明顯降低，FOXK1 mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測破骨細胞FOXK1蛋白表達

表2 破骨細胞中FOXK1和miR-187-3p表達量

2.3高表達miR-187-3p抑制破骨細胞活性和分化，促進細胞凋亡 與miR-NC組比較，miR-187-3p組細胞活力明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv mRNA表達水平明顯降低，miR-187-3p、Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(均P<0.05)，見圖3、表3。

2.4高表達FOXK1促進破骨細胞活性和分化，抑制細胞凋亡 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-FOXK1組細胞活力明顯明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，FOXK1、Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv mRNA表達水平明顯升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見表4、圖4。

圖3 高表達miR-187-3p抑制破骨細胞活性和分化，促進細胞凋亡

表3 高表達miR-187-3p抑制破骨細胞活性和分化，促進細胞凋亡

圖4 高表達FOXK1對破骨細胞活性、分化細胞凋亡的影響

表4 高表達FOXK1對破骨細胞活性、分化、抑制細胞凋亡的影響

2.5miR-187-3p靶向表達FOXK1 starbase預測顯示miR-187-3p和FOXK1存在結合位點，見圖5。miR-187-3p過表達可明顯降低野生型載體WT-FOXK1的熒光素酶活性(P<0.05)，見表5。miR-NC組FOXK1蛋白表達為(0.92±0.09)，miR-187-3p組為(0.43±0.04)，anti-miR-NC組為(0.94±0.08)，anti-miR-187-3p組為(1.37±0.13)。與miR-NC組、anti-miR-NC組比較，miR-187-3p過表達可抑制FOXK1表達，抑制miR-187-3p表達可促進FOXK1表達(P<0.05)，見圖6。

圖5 通過starbase對miR-187-3p和FOXK1結合進行預測示意圖

表5 miR-NC或 FOXK1與報告質粒共轉染MC3T3-E1細胞后雙熒光素酶活性檢測

1～5:miR-NC組，miR-187-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-187-3p組圖6 Western印跡檢測4組FOXK1蛋白表達

2.6FOXK1高表達可以逆轉miR-187-3p高表達對破骨細胞增殖、凋亡、分化的影響 與miR-187-3p+pcDNA-NC組比較，miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組細胞活力明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv的表達水平明顯升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖7、圖8、表6。

圖7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

1，2：miR-187-3p+pcDNA-NC組,miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組圖8 Western印跡檢測FOXK1、Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表6 FOXK1高表達可以逆轉miR-187-3p高表達對破骨細胞增殖、凋亡、分化的影響

2.7NF-κB信號通路蛋白表達 與NC組比較，miR-187-3p組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯降低(P<0.05)，pcDNA-FOXK1組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與miR-187-3p+pcDNA-NC組比較，miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(P<0.05)，見圖9、表7。

1～6:NC組,miR-NC組,miR-187-3p組,pcDNA-FOXK1組, miR-187-3p+pcDNA-NC組,miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組圖9 Western印跡檢測p-p65、p-IкBα蛋白的表達

表7 各組NF-κB信號通路蛋白的表達

3 討 論

miRNA在OP中表達異常，并可能參與OP發(fā)生及發(fā)展過程，骨吸收性骨細胞、骨形成性成骨細胞與骨骼修復密切相關，破骨細胞分化過程與破骨細胞前體表達的NF-κB密切相關，既往研究顯示，miR-133a通過促進破骨細胞分化參與絕經后OP發(fā)生過程〔9〕。miR-29a通過調節(jié)PCAF介導的RANKL和CXCL12而抑制破骨細胞的形成并預防OP〔10〕。miR-483-5p通過促進破骨細胞分化參與OP的發(fā)病過程〔11〕。

miR-187-3p過表達通過抑制IL-1β釋放而減輕缺血再灌注損傷〔12〕。LncRNA PVT1通過靶向miR-187-3p/AGO1軸促進阿霉素誘導的心肌細胞凋亡〔13〕。研究表明Ki-67與細胞增殖有關，其水平升高表示細胞增殖能力增強〔14〕。本研究結果提示，miR-187-3p過表達可抑制破骨細胞增殖。caspase級聯反應激活可誘導細胞凋亡〔15〕。本研究結果顯示，miR-187-3p過表達可促進破骨細胞凋亡。Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv基因與破骨細胞分化密切相關，其表達水平升高表示細胞分化能力增強〔16,17〕。本研究結果提示，miR-187-3p過表達可抑制破骨細胞分化。

本研究證實FOXK1是miR-187-3p的靶基因，miR-187-3p可負向調控FOXK1的表達。研究表明miR-186-5p通過靶向FOXK1在人骨肉瘤中發(fā)揮抑癌作用〔18〕。甘草酸通過調節(jié)NF-κB、ERK和JNK信號通路抑制破骨細胞分化〔19〕。NF-κB信號通路被激活后可促進破骨細胞形成〔20〕。本研究結果提示miR-187-3p過表達可能通過調控FOXK1/NF-κB信號通路而發(fā)揮作用。