基于RhoA/ROCK通路探討赤芍總苷對(duì)心肌梗死大鼠心肌凋亡的影響

張濤 毛治尉 豆倩云 錢晨旭 趙智琛

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

心肌梗死(MI)是持續(xù)的缺血缺氧導(dǎo)致的心肌壞死性病變，產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)心肌壞死和凋亡，心功能下降〔1〕。成年的心肌凋亡屬終末分化細(xì)胞，一旦受損，很難修復(fù)，而心肌細(xì)胞損傷會(huì)降低心肌功能并導(dǎo)致疾病發(fā)生，且心肌細(xì)胞凋亡會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致MI的惡化，影響左心室重構(gòu)和加速心衰，因此減輕心肌細(xì)胞凋亡對(duì)MI具有較高意義。赤芍總苷(TPG)作為中藥赤芍主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用〔2〕，但作用機(jī)制尚不清楚。抑制RhoA/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)通路可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌的保護(hù)〔3〕。本研究探討TPG是否通過RhoA/ROCK通路發(fā)揮對(duì)MI大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)-2016-0006，6周齡，體重200～220 g，大鼠均在溫度(25±1)℃、濕度(50±5)%、自然光照的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2藥物、試劑與儀器 TPG(中國(guó)國(guó)際生物制品所)；RhoA激活劑溶血磷脂酸(LPA)(美國(guó)Sigma公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、RhoA、ROCK(英國(guó)Abcam公司)。小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司，型號(hào)：HX-101E)；心電圖機(jī)(上海光電儀器有限公司，型號(hào)：ECG-6511)；全自動(dòng)生化分析儀(康宇醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：BS-330E)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司，型號(hào)：DxFLEX)；蛋白凝膠成像儀(美國(guó)Invitrogen公司，型號(hào)：E-Gel174)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模與分組 30只大鼠采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法〔4〕建立MI大鼠模型，麻醉大鼠后固定在鼠板上，背位固定，大鼠連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，并連接心電圖機(jī)。大鼠左胸前區(qū)第3肋間開胸，肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界下源1～2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，迅速止血后逐層縫合，關(guān)閉胸腔。MI判斷標(biāo)準(zhǔn)為心電圖顯示2個(gè)以上肢體導(dǎo)聯(lián)或胸導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高〔5〕。造模過程中死亡4只，2只不符合MI標(biāo)準(zhǔn)，模型成功24只，隨機(jī)分為MI組、TPG組、TPG+LPA組，每組8只。假手術(shù)組8只大鼠除不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈外，其余步驟與模型相同。術(shù)后3 d腹腔連續(xù)注射20萬U青霉素防止感染。模型成功后TPG組灌胃54 mg/kg TPG〔6〕，TPG+LPA組灌胃54 mg/kg TPG+腹腔注射RhoA激活劑LPA 10 mg/kg，假手術(shù)組、MI組灌胃等體積生理鹽水，1次/d、連續(xù)4 w。

1.2.2大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察大鼠一般情況，包括：精神狀態(tài)、活動(dòng)量、進(jìn)食量、呼吸情況及皮毛情況。

1.2.3全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌損傷指標(biāo) 肌酸激酶同工酶(CK)-MB、心肌肌鈣蛋白(cTn)I、cTnT情況立即處死大鼠，心臟采血，立即取出心房和右心室，結(jié)扎點(diǎn)下橫切2～3 mm置于4%多聚甲醛中固定，緊接著取50 mg新鮮組織備用，其余置于-80℃冰箱備用。血液置于室溫放置0.5 h，3 000 r/min離心10 min，上清為血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)CK-MB、cTnI、cTnT水平。

1.2.4HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)情況 固定于4%多聚甲醛中的組織經(jīng)乙醇溶液(低濃度-高濃度)脫水，100%乙醇Ⅰ浸泡、100%乙醇Ⅱ浸泡，石蠟包埋、冷凍凝固后切片(厚度：5 μm)。切片脫蠟，乙醇溶液(高濃度-低濃度)復(fù)水，滴加蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、0.5%伊紅染色液染色，乙醇溶液(低濃度-高濃度)脫水，滴加松節(jié)油透明、中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5TUNEL檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡情況1.2.4切片按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)凋亡情況，TUNEL染色可見凋亡細(xì)胞顯綠色，正常細(xì)胞DAPI染色細(xì)胞核顯藍(lán)色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。TUNEL染色陽性細(xì)胞百分比=TUNEL染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡情況 新鮮心肌組織用眼科剪剪成肉糜狀，磷酸緩沖液反復(fù)清洗去除血細(xì)胞，胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶1∶1比例消化，消化完全后300目網(wǎng)篩過濾，添加胎牛血清終止消化。1 000 r/min離心10 min，棄上清，磷酸緩沖液反復(fù)吹打、清洗細(xì)胞，制成心肌細(xì)胞單細(xì)胞懸濁液。5×106個(gè)/ml細(xì)胞取100 μl，加5 μl Annexin V-FITC、2 μl碘化丙啶(PI)溶液，避光冰上孵育10 min，加400 μl冰緩沖液，30min內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7免疫組化檢測(cè)大鼠心肌組織中caspase3蛋白表達(dá)水平1.2.4切片按HE染色相同方法脫蠟、復(fù)水，滴加過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶、加熱修復(fù)抗原，5%脫脂奶粉封片20 min，滴加一抗caspase3(陰性對(duì)照用同型同種鼠IgG代替一抗)室溫孵育2 h，滴加二抗室溫孵育20 min，蘇木素染色，鹽酸酒精分色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡拍照。caspase3主要表達(dá)于細(xì)胞核、部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色呈棕黃色。Image J軟件分析棕黃色面積，caspase3陽性率=棕黃色面積/分析總面積×100%。

1.2.8Wester印跡檢測(cè)大鼠心肌組織中RhoA、ROCK蛋白水平 -80℃冰箱中取部分心肌組織，眼科剪剪成肉糜狀，冰上研磨，加蛋白裂解液冰上裂解20 min，13 000 r/min 4℃離心20 min，取上清為心肌組織總蛋白。凝膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；添加一抗RhoA、ROCK、GAPDH，4℃孵育過夜；加二抗室溫孵育1 h。蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad8.0軟件進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1TPG對(duì)大鼠一般情況的影響 假手術(shù)組精神、活動(dòng)等情況均正常；MI組精神萎靡、活動(dòng)減少、進(jìn)食減少、呼吸加快，皮毛暗淡無光，脫毛量增加；TPG組與MI組相比精神、活動(dòng)、進(jìn)食狀態(tài)有所緩和，呼吸均勻稍有加快；TPG+LPA組狀態(tài)與MI組類似。

2.2TPG對(duì)大鼠心功能的影響 與假手術(shù)組相比，MI組、TPG+LPA組血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平明顯升高，TPG組血清中cTnI、cTnT水平明顯升高(P<0.05)；與MI組相比，TPG組血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平明顯降低，TPG+LPA組血清中cTnI、cTnT水平明顯降低(P<0.05)；與TPG組相比，TPG+LPA組血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 TPG對(duì)血清中CK-MB、cTnI、cTnT水平的影響

2.3TPG對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)的影響 假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，染色均勻；MI組出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞核散落在細(xì)胞外現(xiàn)象或細(xì)胞核固縮、溶解現(xiàn)象明顯，炎癥浸潤(rùn)、纖維化現(xiàn)象嚴(yán)重；TPG組心肌細(xì)胞壞死現(xiàn)象減少，細(xì)胞核固縮、溶解現(xiàn)象緩解；TPG+LPA組心肌細(xì)胞癥狀介于MI組和TPG組之間，出現(xiàn)細(xì)胞核散落在細(xì)胞外現(xiàn)象，但細(xì)胞核固縮、溶解現(xiàn)象不明顯，輕微的纖維化現(xiàn)象。見圖1。

2.4TUNEL染色檢測(cè)TPG對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 與假手術(shù)組〔(5.46±0.19)%〕比較，MI組、TPG+LPA組TUNEL陽性細(xì)胞比例〔(31.14±3.86)%、(23.48±2.38)%〕明顯升高(P<0.05)；與MI組比較，TPG組TUNEL陽性細(xì)胞比例〔(12.36±1.39)%〕明顯降低(P<0.05)；與TPG組比較，TPG+LPA組TUNEL陽性細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。見圖2。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TPG對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響與假手術(shù)組〔(3.15±0.22)%〕相比，MI組、TPG組、TPG+LPA組心肌細(xì)胞凋亡比例〔(23.45±1.86)%、(7.49±0.59)%、(15.22±0.38)%〕明顯升高(P<0.05)；與MI組比較，TPG組、TPG+LPA組心肌細(xì)胞凋亡比例明顯降低(P<0.05)；與TPG組比較，TPG+LPA組心肌細(xì)胞凋亡比例明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組心肌組織形態(tài)(HE染色，×100)

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡(×200)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡

2.6TPG對(duì)心肌組織中caspase3蛋白的影響 與假手術(shù)組〔(2.13±0.36)%〕比較，MI組、TPG+LPA組心肌組織中caspase3蛋白陽性率〔(36.49±3.61)%、(26.49±3.12)%〕明顯升高(P<0.05)；與MI組比較，TPG組心肌組織中caspase3蛋白陽性率〔(12.16±2.13)%〕明顯降低(P<0.05)；與TPG組比較，TPG+LPA組心肌組織中caspase3蛋白陽性率明顯升高(P<0.05)。見圖4。

2.7TPG對(duì)心肌組織中RhoA/ROCK通路蛋白的影響 與假手術(shù)組比較，MI組、TPG+LPA組心肌組織中RhoA、ROCK蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與MI組比較，TPG組心肌組織中RhoA、ROCK蛋白水平明顯降低，TPG+LPA組ROCK蛋白水平降低(P<0.05)；與TPG組比較，TPG+LPA組心肌組織中RhoA、ROCK蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖5、表2。

圖4 TPG對(duì)心肌組織中caspase3蛋白的影響(免疫組化，×400)

圖5 TPG對(duì)心肌組織中RhoA、ROCK蛋白的影響

表2 TPG對(duì)大鼠心肌組織中RhoA、ROCK蛋白的影響

3 討 論

MI中醫(yī)論治屬“胸痹”“心悸”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載“心痛病著，胸中痛、脅痛、肩背胛間痛、兩臂內(nèi)痛”即為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中心絞痛、MI，故有“不通則痛”病理論述，與中醫(yī)描述心陽不足、氣滯血瘀、血脈不通機(jī)理一致〔7，8〕。赤芍為毛莨科赤芍或川赤芍干燥根，《神農(nóng)本草經(jīng)》和歷代醫(yī)籍中均有記載，具有清熱解毒、活血祛瘀之功效，在保護(hù)心血管、抗血管生成、抗血小板等方面具有重要價(jià)值〔9〕。本研究提示，MI大鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的損傷，破壞嚴(yán)重。經(jīng)TPG治療后，精神、活動(dòng)等現(xiàn)狀均有所緩和，心肌組織壞死現(xiàn)象得以緩解。CK-MB、cTnI、cTnT是臨床上常見的3種心肌損傷指標(biāo)，CK-MB正常情況下存在心肌細(xì)胞中，在心肌嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)才可被測(cè)出，是心肌酶中升高時(shí)間最早、幅度最大指標(biāo)〔10〕。cTnI、cTnT結(jié)構(gòu)不同，cTnI絕大多數(shù)存在于心肌細(xì)胞中；cTnT表現(xiàn)為不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，正常情況下cTnI、cTnT不會(huì)釋放入血，當(dāng)心肌細(xì)胞損傷或出現(xiàn)細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)時(shí)，cTnI、cTnT進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，進(jìn)入血液循環(huán)〔11,12〕。本研究提示，TPG可以改善MI中心肌細(xì)胞損傷情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的保護(hù)。細(xì)胞凋亡伴隨著細(xì)胞增殖、分化、自噬、發(fā)育、成熟等過程，參與多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展，心肌細(xì)胞凋亡已成為MI發(fā)病的主要機(jī)制〔13〕。caspase3被認(rèn)為是激活各種凋亡刺激因子caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，可對(duì)多種蛋白底物進(jìn)行降解，從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔14〕；減少caspase3水平可減少心肌細(xì)胞凋亡，為心肌保護(hù)提供參考〔15〕。本研究提示，TPG可以緩解細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)。Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白成員之一，由RhoA、RhoB、RhoC等亞型組成，目前研究最廣泛的是RhoA，起“分子開關(guān)”作用〔16〕；ROCK是第一個(gè)被證明可影響肌動(dòng)蛋白組建、細(xì)胞骨架重組、張力纖維形成、纖維收縮等多種功能〔17〕。在MI中RhoA/ROCK通路處于激活狀態(tài)，參與動(dòng)脈粥樣硬化、血管平滑肌收縮、內(nèi)皮細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等過程〔18,19〕。ROCK可直接裂解caspase3的底物，在心肌中高表達(dá)又可激活caspase3，在病理?xiàng)l件下ROCK與caspase3二者正反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，加重疾病〔20〕。本研究提示，MI中RhoA/ROCK通路處于激活狀態(tài)，可導(dǎo)致生成caspase3底物裂解，同時(shí)激活caspase3，加重心肌細(xì)胞凋亡；與MI組相比，TPG組心肌組織中RhoA/ROCK通路被抑制，從而緩解細(xì)胞凋亡過程。在TPG的基礎(chǔ)上添加RhoA激活劑LPA后可逆轉(zhuǎn)TPG對(duì)MI心肌細(xì)胞凋亡的緩解。