加味柴胡疏肝散通過調控AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路抑制小鼠酒精性肝損傷

張兆鵬 閆俏 馬欣宇 呼雅麗 郭軍鵬 劉洋

(1長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2長春醫學高等專科學校)

酒精性肝病(ALD)是一種長期酗酒引起的慢性肝損傷疾病。流行病調查發現，雖然適量飲酒有利于身心健康，如預防心臟病、高血壓和糖尿病，但過度和長期飲酒會導致酒精性肝病〔1〕。ALD是全球肝病發病的主要致病因素，并呈逐年上升趨勢〔2〕。現代醫學對ALD的治療主要基于戒酒、營養支持、使用護肝藥物、改善肝損傷和預防并發癥，臨床治療依舊存在一定局限性〔3～6〕。

中醫認為，ALD為氣、血、痰、濕相互搏結，長久無法及時疏散和排出體外，因此中醫治療多釆用行氣、活血、解毒及扶正藥配伍〔7，8〕。本研究從中醫整體觀念出發，基于清解酒毒、化瘀散結的學說，以柴胡疏肝散為基本方配以烏藥，行補肝益腎，又兼顧健脾、活血化瘀的功能，共奏降低酒精性肝損傷的功效。目前加味柴胡疏肝散(JWCH)對于酒精性肝損傷的實驗研究較少，本研究通過酒精灌胃復制ALD動物模型，探究此方劑對于ALD的保護作用和分子機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 40只SPF級昆明小鼠〔遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001〕，雌雄各半，體重(22±2)g，飼養于溫度為22～ 26℃的實驗動物屏障環境中，12 h晝/夜循環照明。

1.2藥品和試劑 實驗用中藥購自長春中醫藥大學附屬醫院。三酰甘油(TG)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自北京華英生物試劑有限公司，批號分別為(20210622、20210625、20210625、20210627、20210624、20210628、20210625、20210622)；抗體蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、核因子NF-E2相關因子(Nrf)2、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、p-GSK-3β、β-actin均購自 proteintech生物技術有限公司。

1.3藥物制備 根據藥典及臨床用藥劑量可知人用劑量為：陳皮6 g、柴胡6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳殼4.5 g、芍藥4.5 g、甘草1.5 g、烏藥4.5 g。根據人與小鼠體表面積換算得小鼠低、高劑量。水煎煮藥材2次，濃縮備用。

1.4造模及給藥 小鼠隨機分為對照組、模型組、JWCH低劑量(JWCH-L)組、高劑量(JWCH-H)組，每組10只，雌雄各半。除對照組外，其余各組每天定時灌胃給予50°酒精(10 ml/kg)，連續灌胃4 w。第5周開始，對照組和模型組灌胃給予20 ml/kg生理鹽水，JWCH-L、JWCH-H組分別灌胃給予50 g/kg、150 g/kg柴胡疏肝散，連續給藥2 w。

1.5肝臟指數 造模結束，稱量小鼠體重，完整取出肝臟并稱量，肝臟指數(%)=肝臟質量(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.6血清生化指標 小鼠眼眶靜脈叢取血，靜置30 min，以3 500 r/min離心15 min，提取上清，嚴格按照試劑盒說明書，檢測TG、ALT、AST、CAT、GSH-Px、ROS、SOD在血清中的含量。

1.7肝組織病理學檢查 取部分肝臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察、拍照。

1.8Western印跡檢測肝組織相關蛋白表達 取冷凍肝臟組織50 mg，提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白濃度。一抗〔AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、GSK-3β(1∶2 000)、p-GSK-3β(1∶3 000)、Nrf2(1∶3 000)〕，4℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學發光(ECL)顯影，圖片采用Image J軟件進行圖片處理分析。

1.9統計學方法 采用SPSS26.0統計學軟件進行單因素方差分析和GraphPad Prism8繪圖軟件處理。

2 結 果

2.1JWCH對ALD小鼠體重和肝臟指數的影響 與對照組比較，模型組體重和肝臟指數明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，JWCH-L及JWCH-H組體重和肝臟指數明顯減小(P<0.05)。見表1。

2.2JWCH對ALD小鼠血清TG、ALT、AST水平的影響 與對照組比較，模型組血清中TG、ALT、AST含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，JWCH-L及JWCH-H組血清中TG、ALT、AST含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.3JWCH對ALD小鼠血清CAT、GSH-Px、ROS和SOD水平的影響 與對照組比較，模型組血清中CAT、GSH-Px、SOD含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，ROS含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，JWCH-L及JWCH-H組血清中CAT、GSH-Px、SOD含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，ROS含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.4JWCH對ALD小鼠肝臟組織p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達影響 與對照組相比，模型組肝臟組織p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，JWCH各治療組p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達明顯增加(P<0.01，P<0.05)。見表2、圖1。

表1 JWCH對ALD肝臟指數及TG、ALT、AST含量的影響

2.5JWCH對ALD小鼠肝臟組織HE染色 對照組肝組織結構完整，細胞排列整齊，血竇走行脈絡清晰。模型組肝組織可見肝細胞氣球樣變，出現部分水腫壞死、肝細胞胞質內出現脂肪空泡，肝竇變窄并伴有明顯炎性細胞浸潤；與模型組相比，JWCH各治療組肝臟組織上述肝臟病理組織形態改變明顯較輕，且部分肝組織損傷恢復明顯。見圖2。

表2 JWCH對ALD小鼠血清中CAT、GSH-Px、ROS、SOD含量及肝臟組織p-AKT、p-GSH3β、Nrf2蛋白表達的影響

1～4：對照組、模型組、JWCH-L組、JWCH-H組圖1 JWCH對ALD小鼠肝臟組織p-AKT、p-GSK3β、Nrf2的蛋白表達

圖2 JWCH對ALD小鼠肝臟的影響(HE染色，大圖×100，小圖×400)

3 討 論

目前認為，ALD的發生發展機制為酒精在肝臟代謝轉換的過程中刺激或激發了肝臟炎癥反應和氧化應激反應〔9～11〕。已有研究發現，酒精在肝臟中部分被轉化為乙醛，由于體內乙醇脫氫酶的活性比乙醛脫氫酶活性高很多，因此造成乙醛在體內堆積無法快速代謝出體外〔12～14〕。乙醛具有很強的毒性效應，影響肝臟中線粒體呼吸鏈的正常活動，造成線粒體氧化還原反應障礙，氧自由基生成增多，肝臟氧化應激性損傷加重〔15〕；同時酒精和乙醛還干擾了脂類轉運和代謝酶類，造成脂類進入肝臟后不能轉運出肝而形成脂肪變性〔16，17〕。

在中醫學中，將酒歸為濕熱品行列，少量飲酒可以促進全身氣血暢通，有益于機體健康。但過量飲酒必然會對機體器官造成一定的傷害，累及肝臟及脾胃，導致體內濕熱酒毒內藏不散，這也是中醫學中ALD病機所在〔18，19〕。柴胡舒肝散是治療肝臟氣血瘀滯、行氣活血的代表方。《靈樞·五邪》篇論：“邪在肝，則兩脅中痛”，現代醫家亦認為氣滯、血瘀、濕熱而致病機，均可以本方為基礎加減治療〔20〕。有研究表明，該方中柴胡、白芍、川芎具有降低ALD模型血清中ALT、AST、TG水平〔21～23〕。JWCH具有明顯升高肝組織中抗氧化物質，有效消除過量自由基及減少炎癥的作用〔24〕。

本研究說明，JWCH改善ALD的主要作用機制是通過清除氧自由基或抑制其生成。 酒精對于肝臟的損傷主要通過影響胰島素受體(INSR)進而影響肝臟的代謝和肝細胞的增殖〔25〕。INSR下游信號通路主要蛋白主要是AKT/GSK-3β〔26〕。AKT/GSK-3β通路的適當激活對于肝臟中能量代謝和細胞存活至關重要〔27，28〕。AKT/GSK-3β通路已被證明可以減輕酒精誘導的肝損傷。大量研究發現，GSK-3β通過將 Nrf2 核轉出和磷酸化而下調其功能，Nrf2入核后靶向抗氧化基因啟動元件，提高機體抗氧化能力〔29，30〕。本研究發現JWCH能夠調節p-AKT、p-GSK-3β和Nrf2蛋白表達，說明AKT/GSK-3β/Nrf2參與了JWCH的肝保護作用。

綜上，JWCH對ALD小鼠肝臟具有明顯的保護作用，其機制可能與JWCH調節AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路、抑制ALD肝臟氧化應激反應有關。