臭氧水療法對KOA大鼠關節軟骨及Wnt/β-catenin信號通路的影響

丁小芬 周友龍 田明月 韓松辰 賈夢雅 李彥華 楊志孟 王晶

(河南中醫藥大學第三臨床醫學院，河南 鄭州 450008)

膝關節骨性關節炎(KOA)是一種關節退行性疾病，臨床常見于中老年人，其主要病理特征為進行性關節軟骨退化，膝關節退變由衰老、肥胖、外傷、關節不穩、過度使用或其他異常負荷引起〔1〕，臨床癥狀常包括關節腫脹、疼痛、活動受限、關節畸形等。KOA是引發全球患病老年人口慢性疼痛和導致殘疾的主要原因〔2～4〕，在60歲以上人群中影響多達1/3以上〔5〕。西醫治療該病易出現不良反應，中醫治療起效較慢，周友龍等〔6～8〕采用中西醫結合療法，運用臭氧水關節腔聯合穴位注射治療KOA，可有效緩解疼痛、改善關節活動度、創傷小、無明顯毒副作用、療程短、療效確切。

KOA的發病機制比較復雜，近年來，學者們發現調控關節形成和內環境穩態的眾多信號通路是導致KOA發病的關鍵因素，其中經典通路Wnt/β-catenin信號通路被認為是重要的通路之一〔9,10〕，炎癥環境下該通路被激活，下游靶基因基質金屬蛋白酶(MMPs)過度表達，導致細胞外基質過度降解，關節軟骨破壞〔11,12〕。本實驗通過關節腔注射木瓜蛋白酶建立KOA大鼠模型，基于Wnt/β-catenin信號通路探討臭氧水關節腔聯合穴位注射治療KOA的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物:3月齡SPF級雄性SD大鼠48只，體重(300±20)g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCKX(魯)20190003，在河南中醫藥大學實驗動物中心常規飼養，1 w后用于模型制備。主要試劑:木瓜蛋白酶、左旋半胱氨酸(批號：SLCD866、STBJ3975)購于美國Sigma-Aldrich公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號：20200817)購于北京索萊寶科技有限公司；β-catenin、Wnt3a、MMP-13抗體(批號：A19657、 A13601、A11148、A2562)購于美國ABclona公司；GAPDH抗體(批號：60004-1-lg)購于武漢三鷹生物技術有限公司；總RNA提取試劑盒(批號：20200522)購于北京索萊寶科技有限公司；逆轉錄試劑盒(批號：00753607)購于美國Thermo Fisher公司；2X通用型SYBR Green快速定量聚合酶鏈反應(qPCR)預混液(批號：9619031126)購于美國ABclona公司。主要儀器:醫用臭氧水制備儀(型號：SYZ-80A)購自濟南三氧科技有限公司；病理切片機(型號：RM2016)上海徠卡儀器有限公司；全波長酶標儀、離心機、核酸蛋白濃度微量測定儀(型號：Multiskan GO、ST16R、Nanodrop 2000)購于美國Thermo Fisher公司；熒光定量PCR儀(型號：TL-988)西安天隆科技有限公司。

1.2分組與造模 將48只大鼠隨機分為空白組(12只)和造模組(36只)，造模組分別在實驗的第1、4、7天行關節腔內注射4%木瓜蛋白酶溶液〔13〕：稱量大鼠體重，常規碘伏消毒，術者戴無菌手套，用2 ml的注射器按大鼠體重按照劑量(5 ml/kg)的劑量抽取10%水合氯醛溶液，以45°斜刺進行腹腔注射麻醉，剪去大鼠右后膝關節周邊1 cm區域的皮毛，屈曲大鼠右后膝關節45°，使用微量注射器按大鼠體重按照劑量(0.1 ml/kg)抽取木瓜蛋白酶溶液劑量，以髕骨下及髕腱外緣為進針點，向髁間窩方向進針，抵達股骨髁后回撤2 mm，將木瓜蛋白酶溶液推入即可。造模結束后空白組取1只、造模組取3只大鼠，分別處死取關節軟骨組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色，驗證造模成功。再將造模組隨機分為模型組、生理鹽水組、臭氧水組，每組11只。

1.3實驗干預 于最后1次注射木瓜蛋白酶3 w后開始干預，空白組、模型組采取同樣抓取，不予治療；臭氧水組向大鼠右膝關節腔內注射20 μg/ml的臭氧水0.2 ml，“梁丘”“血海”“陰陵泉”“陽陵泉”“三陰交”行穴位注射，每穴20 μl，1次/w，共治療3 w；生理鹽水組操作同臭氧水組，僅是把藥物由20 μg/ml臭氧水換成0.9%生理鹽水。

1.4樣本取材及檢測分析

1.4.1取材 采用頸椎脫臼法分別處死各組大鼠，將大鼠右膝關節處皮膚切開暴露皮下膝關節，被動彎曲膝關節，用手術刀切開髕下韌帶，然后用鑷子夾住髕下組織連同髕骨一起用力向上牽拉，再依次剪去關節周圍其他組織和韌帶，以充分暴露關節軟骨。用刀片盡量切下股骨遠端、脛骨近端的關節軟骨。每組隨機選取3只大鼠的右側膝關節標本置于裝有4%多聚甲醛的離心管中固定，進行病理切片的制作和觀察；各組剩余8只大鼠的右側膝關節標本，放入標好號碼的凍存管用液氮保存，轉運至-80℃冰箱，用于Western印跡和實時熒光定量(RT)-PCR檢測。

1.4.2HE染色 取軟骨組織脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋后制備軟骨組織切片，參考HE染色試劑盒對切片進行染色，光鏡下觀察，并參照改良Mankin評分標準對各組關節軟骨評分。

1.4.3Western印跡檢測軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白表達情況 取各組凍存的軟骨組織，加入裂解液置于高速組織研磨儀上進來組織研磨，測定蛋白濃度后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胺電泳(SDS-PAGE)分離后轉膜、封閉，采取Wnt3a、β-catenin、MMP-13、GAPDH一抗孵育聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃過夜后，用辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗與膜接觸，室溫振搖反應1 h，在暗室中，將膜浸入發光液顯影，以GAPDH為內參，用凝膠圖像處理系統分析Wnt3a、β-catenin、MMP-13各蛋白條帶的灰度值。

1.4.4RT-PCR檢測軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13 mRNA表達情況 將凍存的關節軟骨解凍后將軟骨削成碎屑狀，按Trizol試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測Wnt3a、β-catenin、MMP-13 mRNA表達水平，選用GAPDH作為內參，反應程序為首先預變性95℃作用3 min；變性95℃作用15 s，退火60℃作用1 min，延伸72℃作用1 min，進行35個循環；引物由江蘇金唯智生物科技有限公司合成。GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；Wnt3a上游引物：5′-CAGGGCACTAACAAGTCGGG-3′，下游：5′-CCACACTGGGCATGATCTCC-3′；β-catenin上游引物：5′-ACTCCAGGAATGAAGGCGTG-3′，下游：5′-GAACTGGTCAGCTCAACCGA-3′；MMP-13上游引物：5′-ACCCAGCCCTATCCCTTGAT-3′，下游：5′-TCTCGGGATGGATGCTCGTA-3′。利用2-ΔΔCt法分別計算出Wnt3a、β-catenin、MMP-13mRNA的表達量。

1.5統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1HE染色結果 空白組關節軟骨表面光滑，無缺損，四層結構(淺表層、過渡層、輻射層和鈣化層)排列規則可見，無血管侵入，潮線完整，軟骨細胞數量正常，軟骨基質著色均勻；模型組關節軟骨破壞嚴重、不完整，表面粗糙不光滑，有裂隙形成，四層結構紊亂，有血管侵入，潮線不完整，過渡層細胞緊密排列現象消失，軟骨細胞變性數量減少、排列混亂、分布不均勻、呈簇狀分布，可見軟骨細胞凋亡現象，軟骨基質著色不均勻；生理鹽水組關節軟骨表面粗糙，有少量裂隙形成，四層結構層次不清，潮線結構少量破壞，軟骨細胞數量減少、排列不整齊，可見部分軟骨細胞部分凋亡現象，軟骨基質著色較均勻；臭氧水組：關節軟骨表面較光滑，未見明顯裂隙產生，四層結構層次清楚，潮線結構絕大部分完整、個別不完整，軟骨細胞數量基本正常、排列整齊、分布較均勻，軟骨基質著色均勻。見圖1。

圖1 各組軟骨組織病理形態(HE染色，×200)

2.2光鏡下對各組軟骨組織病理切片行改良Mankin評分 與空白組〔(0.00±0.00)分〕相比，模型組〔(7.67±1.53)分〕、生理鹽水組〔(5.00±1.00)分〕及臭氧水組改良Mankin評分〔(2.33±0.58)分〕均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，生理鹽水組和臭氧水組評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與生理鹽水組相比，臭氧水組評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3Western印跡檢測軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達水平 與空白組相比，模型組、生理鹽水組、臭氧水組軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達水平均增高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，生理鹽水組、臭氧水組軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與生理鹽水組相比，臭氧水組軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 各組目的蛋白印跡

表1 各組軟骨組織內Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達

3 討 論

KOA屬于中醫“痹癥”范疇，在古代醫案中有“骨痹”“鶴膝風”“歷節”等類似該病的記載，主要病機特點為人體正氣不足，肝腎虧虛為主要因素，風寒濕邪侵襲為誘發因素〔14〕。西醫認為KOA與金屬蛋白酶、細胞因子、激素水平、免疫因素、信號通路等多種機制綜合作用有關〔15〕，其中，軟骨細胞凋亡和軟骨基質合成與降解之間的失衡是軟骨變性和損傷的重要原因〔16〕，KOA發生時炎癥因子表達上調，通過一系列信號轉導將信號向下游傳遞，引發軟骨退變。其中，已經證明Wnt信號通路是骨關節炎發展的關鍵〔17〕，Wnt/β-catenin信號通路是軟骨發育和骨重塑的重要機制，通過信號轉導誘導下游MMPs表達，導致關節軟骨細胞外基質改變和軟骨破壞，是調節關節炎發生發展的重要信號通路之一〔18〕。Wnt3a配體可與跨膜蛋白分泌型FZ相關蛋白(sFRP)上富含半胱氨酸的區域結合，激活經典Wnt信號通路〔19〕，β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路上的核心蛋白，在信號轉導過程中起主導作用，β-catenin在細胞質中積累后可進入細胞核內參與轉錄，促進下游靶向介導的MMPs等的表達，尤其是MMP-13對Ⅱ型膠原的降解性較強，是促進軟骨基質降解的關鍵酶，在軟骨破壞中起核心作用〔20〕。

本研究采用關節腔內注射木瓜蛋白酶復制KOA大鼠模型，木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，通過將硫酸軟骨素從關節軟骨基質的蛋白多糖復合物中釋放出來，導致關節軟骨穩態無法維持，正常的應力也會造成軟骨損傷而引起KOA，但對軟骨細胞和膠原蛋白沒有直接影響，不會干擾軟骨組織的修復機制和修復能力〔21〕。本研究中生理鹽水組有治療作用是由于生理鹽水組向大鼠“陰陵泉”“陽陵泉”“梁丘”“血?！薄白闳铩薄叭幗弧毖ㄎ粌茸⑸渖睇}水，對穴位產生了刺激，發揮了穴位的治療作用。袁佳夢〔22〕研究發現毫針刺KOA模型兔“犢鼻”“內膝眼”“梁丘”“血?！焙突疳槾獭盃俦恰薄皟认パ邸敝委煴容^差異無統計學意義，發現通過對穴位的刺激可能抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導，關節軟骨內β-catenin的表達被抑制，阻止了Wnt信號的傳遞，從而減少了下游MMP-3和MMP-13的表達，緩解關節軟骨的退變。本研究結果顯示，經臭氧水關節腔聯合穴位注射干預后，對關節軟骨保護作用明顯，臭氧水作為一種強氧化劑，可誘導超氧化物歧化酶(SOD)過度表達，從而清除病理過程中產生的過多活性氧(ROS)，還能刺激抗炎因子的產生，改善關節內的炎癥環境〔23〕，可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉導，導致該通路的配體Wnt3a不能與跨膜蛋白有效結合，β-catenin不能在細胞質內聚集進入細胞核內，從而抑制下游靶基因MMP-13表達，抑制關節軟骨內細胞外基質的降解，從而延緩關節軟骨的破壞。

綜上，Wnt/β-catenin信號通路在KOA大鼠關節軟骨內被激活，阻止該信號通路的轉導可以改善關節軟骨的破壞。臭氧水關節腔聯合穴位注射療法可以改善KOA大鼠關節軟骨病理評分，有效延緩關節軟骨的退變，其作用機制可能是抑制正調節因子Wnt3a和β-catenin的表達，從而降低了下游靶基因MMP-13的表達，抑制了Wnt/β-catenin信號通路的轉導，減少軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解，延緩關節軟骨退變，這可能是臭氧水療法治療KOA的作用機制之一。