亞低溫對SAH大鼠ROS表達水平及神經元細胞的影響

姚書眈 王力航 湯倩 陳啟鸰 蒲興魏 陸廷盛 羅春山

(1貴州省骨科醫院脊柱外科，貴州 貴陽 550004；2貴州醫科大學附屬醫院燒傷整形科)

蛛網膜下腔出血(SAH)預后較差〔1〕。根據病理生理特征，該病的病程可分為兩個階段：早期腦損傷和晚發性腦血管痙攣〔2〕。研究表明，在SAH急性期，諸如顱內壓升高和總腦血流量減少等病理變化是SAH預后不良的重要原因〔3〕。研究病因并探索減緩SAH急性期進程的有效措施對其治療至關重要〔4〕。線粒體的氧化應激和異常的能量代謝是急性期SAH的重要原因之一。SAH急性期的腦缺血和缺氧會釋放大量線粒體活性氧(ROS)，并容易對神經組織造成氧化損傷〔5,6〕。此外，過量ROS還可通過活化Toll樣受體(TLR)、降鈣素基因相關肽(CGRP)等信號通路,導致線粒體細胞凋亡,抑制線粒體生物合成,損傷線粒體能量代謝,誘導炎癥反應和細胞凋亡〔7〕。已有諸多研究報道顯示，亞低溫能夠顯著改善腦部疾病患者的組織損傷程度〔8〕。研究表明，在SAH急性期進行亞低溫干預對腦血管痙攣的延遲沒有緩解作用，但可以改善腦組織的缺氧耐受性，從而減少SAH的晚期腦損傷〔9〕。最近的研究表明，在SAH急性期誘導線粒體自噬可以通過消除受損的線粒體來減少神經元凋亡。這表明線粒體功能是SAH急性期大腦保護的重要目標。但是，輕度低溫干預SAH線粒體功能的機制仍不清楚〔10〕。本研究旨在探究亞低溫對自發性SAH大鼠線粒體ROS功能及腦組織液的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 體重為150～186 g的3～4周齡健康雄性SD大鼠，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2儀器與試劑 氯醛(蘇州甫路生物科技有限公司)，石蠟(盛威石化有限公司)，酒精(八方化工有限公司)，乙醇(興旺化工有限公司)，蘇木素(甘肅益生祥生物公司)，伊紅(武漢華翔科潔生物公司)，二甲苯(濟南文泰化工有限公司)，谷氨酸(深圳樂芙生物科技公司)，蘋果酸(江蘇采薇生物科技公司)，二氯熒光素(美國Sigma公司)，蛋白酶K(廣州美基生物科技公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢海山科技有限公司)，樹膠(滄州蜂源蠟業有限公司)，兔抗鼠CGRP(英國Abcam公司)，逆轉錄試劑盒(美國Ferment公司)。實驗中所用引物由上海生工生物工程公司合成。MC-108型電子體溫計(美國Thermo Fisher公司)，恒溫加熱毯(河北方向電器有限公司)，SteponePlus型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3動物模型的制備及分組 將所選取的大鼠隨機分組，常溫(NT)組：制作SAH大鼠模型并處于常溫環境下生長；對照(CO)組：制作假手術模型，注射等量生理鹽水，處于常溫環境下生長；亞低溫(MH)組：制作SAH大鼠模型并處于亞低溫環境下生長，每組6只。

采用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)，將 MC-108型電子體溫計探頭插入大鼠直腸4～5 cm監測肛溫，用恒溫加熱毯將肛溫維持于(37.0±0.5)℃。常規切開大鼠頭頂部皮膚，于前囟前中縫7.5 mm處鉆1孔，于冠狀縫后4.6 mm、中線兩側5 mm處各鉆1孔。30 min后，用1 ml注射器抽取大鼠自體股動脈血0.6 ml。將注射器針頭斜向后30°，刺入前囟前孔，針頭至視交叉前池前3 mm處顱底，于5 min內注入動脈血。腦池注血后腦血流量降低至20%～40%定義為SAH模型制備成功。NT組和CO組大鼠維持腦溫度36.5～37.5℃，MH組大鼠用冰袋覆蓋大鼠體表進行降溫，維持腦溫度32.5～33.5℃，所有大鼠生存環境相同，常規處死大鼠用于后續試驗。

1.4腦組織超微結構觀察 左腦海馬CA1區固定于4%多聚甲醛24 h以上，將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水。取左腦海馬CA1區1 mm3經石蠟包埋，切片后，將其置于烘箱烤2 h。于二甲苯中浸泡脫蠟2遍，每次15 min；梯度濃度酒精脫水；蒸饋水2 min。蘇木素染色液染色3 min。自來水沖洗5 min，蒸餾水浸泡10 min，95%乙醇5 s。伊紅染色液染色30 s。在顯微鏡下觀察染色情況，中性樹膠封片。置于通風處干燥后，在顯微鏡下觀察。

1.5線粒體ROS產生速率測定 采用二氯熒光素法檢測線粒體ROS生成速率，取5 mg線粒體加入測定介質中，再加入谷氨酸、蘋果酸，濃度分別為10、5 mmol/L，啟動線粒體呼吸，繼而加入5 mmoL/L二氯熒光素，37℃避光水浴15 min，發射波長521 nm連續測定2 min，計算線粒體ROS產生速率。

1.6TUNEL法檢測神經元細胞凋亡 石蠟切片置于切片架上烘箱烘烤2 h，脫蠟脫水。滴加20 g/ml不含DNase的蛋白酶K。37℃作用20 min，用PBS洗滌3次。3% H2O2的溶液中室溫作用10 min，PBS洗滌。加生物素標記液50 μl，37℃，孵育60 min，用PBS清洗。加0.1 ml反應終止液終止，室溫作用10 min。在樣品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min。PBS洗滌3次。滴加0.2 ml二氨基聯苯胺(DAB)混合液，在顯微鏡下觀察作用時間。蘇木素復染，梯度濃度酒精脫水；二甲苯透明2遍，每次15 min。中性樹膠封片，于熒光顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.7RT-PCR法檢測大鼠腦組織中CGRP mRNA的表達 把保存在-80℃環境中腦組織取出，研磨，提取總RNA，將逆轉后所得的cDNA進行熒光反應實驗。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增，內參采用GAPDH，CGRP引物序列上游引物：5′-CCTGGTTGTCAGCATCTTG-3′，下游：5′-AGCCTCCTGTTCCTCCTC-3′。GAPDH上游引物：5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。變性3 min 95℃，變性5 s 95℃，退火1 min 60℃，共進行40次。取得到的平均值后得到Ct值，采用2-△△Ct法進行計算并分析。

1.8Western印跡檢測大鼠腦組織中CGRP蛋白含量 洗凈烘干電泳槽及其他部件。將電泳裝置放置聚膠1 h，配制灌注成層膠。0.25%胰酶消化細胞，離心棄上清，加入細胞裂解液，在低溫高速30 min，吸取蛋白上清液。隨后95℃熱浴10 min，對蛋白進行變性。分別加入樣品懸液50 μg/孔。90 V電泳，電泳終止，取出凝膠，甲醇放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜放置5～10 s，加進轉膜液，轉膜槽進行冰浴，70 V，1.5 h。轉膜完成，用TBST洗2次，10 min/次。水平搖床密封2 h。然后把PVDF膜裝進有一抗(兔抗鼠CGRP，1∶1 500，英國Abcam公司)的自制雜交袋內，4℃過夜。待膜取出，洗3次，10 min/次，沖洗完成后，把膜放入對應的二抗(辣根過氧化酶標記熒光抗體，1∶2 000)中常溫孵育1.5 h。洗3次，10 min/次，將ECL顯色液A液和B液混合為工作液，按1:1比例，加工作液至PVDF膜內。大概1 min。PVDF膜檢測采用自動化學發光成像分析。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組腦組織超微結構比較 透射電鏡觀察顯示，CO組CA1區腦組織結構正常，核周邊內質網、線粒體等細胞器豐富；NT組CA1區部分腦組織損傷明顯，細胞器溶解；MH組CA1區腦組織結構基本正常，細胞膜和細胞核結構無明顯損傷，見圖1。

2.2各組線粒體ROS產生速率比較 NT組ROS產生速率〔(17.45±3.12)%〕顯著高于MH組〔(13.17±2.58)%〕；MH組ROS產生速率明顯高于CO組〔(6.43±1.48)%，P<0.05〕。

2.3各組神經元細胞凋亡情況比較 NT組神經元細胞凋亡率(23.65%)顯著高于MH組(13.64%，P<0.05)，MH組神經元細胞凋亡率明顯高于CO組(8.47%，P<0.05)。

2.4各組腦組織中CGRP mRNA表達比較 NT組腦組織的CGRP mRNA表達(0.34±0.12)顯著低于MH組(0.59±0.21，P<0.05)，MH組腦組織的CGRP mRNA表達量明顯低于CO組(0.82±0.26，P<0.05)。

2.5各組腦組織中CGRP蛋白含量比較 NT組腦組織的CGRP 蛋白含量(0.46±0.12)顯著低于MH組(0.74±0.36，P<0.05)，MH組蛋白含量明顯低于CO組(1.03±0.56，P<0.05)。見圖2。

圖1 3組腦組織超微結構

圖2 Western印跡檢測腦組織中CGRP蛋白表達

3 討 論

SAH指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網膜下腔引起的一種臨床綜合征，又稱為原發性SAH，約占急性腦卒中的10%，是較為嚴重的常見疾病〔11〕。導致SAH的常見病因有顱內動脈瘤、動靜脈畸形等，該病在任何年齡均可發病，其中，多見于青年人。SAH發病急促，一旦出現異常癥狀應及時救治，以免相關并發癥的發生，對患者造成二次傷害〔12〕。

相關報道顯示，亞低溫在SAH大鼠發作期間能夠保護大腦，腦組織結構基本恢復，線粒體結構清晰，腦血流量監測結果顯示，亞低溫對腦池注血后腦血流量下降程度及恢復速度無明顯影響，提示亞低溫對SAH急性期的保護效應可能是通過影響神經元內在因素而實現的〔13〕。研究結果表明，亞低溫降低了ROS在線粒體呼吸中所占比例，增加了呼吸鏈氧化磷酸化耦聯程度。腦缺血抑制線粒體呼吸鏈復合體活性是線粒體ROS產生增多和腦組織出現障礙的主要原因〔14〕。研究顯示，亞低溫可改善缺血心肌線粒體呼吸鏈復合體活性，同時，亞低溫可抑制SAH急性期線粒體氧化應激，并促進線粒體能量代謝恢復，防止腦組織進一步受到傷害〔15〕。報道表明，患SAH大鼠體內神經元細胞的凋亡速率與正常健康大鼠相比較有顯著差異，其機制可能為由于疾病導致大鼠腦組織受損，進而加快細胞的凋亡〔16〕。動物實驗研究發現，在發生SAH后的短時間內，為維持腦內血流量，神經末梢內的CGRP大量釋放入血液中，其水平明顯升高。隨時間推移神經末梢中CGRP逐漸耗竭，血液中CGRP水平也逐漸下降，表明SAH的發生可導致CGRP水平大幅波動〔17,18〕。研究發現，亞低溫干預抑制了SAH對腦組織CGRP表達的下調效應，繼而推測，亞低溫可能通過上調CGRP表達來實現SAH急性期腦組織線粒體保護效應，改善SAH急性期線粒體呼吸鏈工作效率，在提高線粒體能量輸出水平的同時也抑制了ROS的產生〔19～21〕。本研究結果與上述結論相近。

綜上，亞低溫可能通過上調CGRP的表達來降低SAH大鼠體內線粒體ROS的活性，從而抑制神經元凋亡。