丁基苯酞對腦出血模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制

譚明萬 黃艷 胡亮 黃方舟

(長沙市第四醫(yī)院急診急救中心，湖南 長沙 410013)

腦出血是一種非外傷性腦組織內(nèi)血管破裂而引起的神經(jīng)內(nèi)科疾病，其病理發(fā)生機(jī)制主要為出血后血腫、局部腦血流改變、周邊水腫帶的形成、炎癥因子及腦組織血管活性物質(zhì)過度釋放等，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的自由基受損和過度凋亡等問題，引起神經(jīng)功能受損〔1,2〕。丁基苯酞是在芹菜籽中提取的化學(xué)成分之一，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其具有增加缺血區(qū)腦灌注〔3〕、清除自由基、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔4〕、減輕腦水腫〔5〕、減少氧化反應(yīng)及炎癥反應(yīng)〔6〕等作用。因丁基苯酞治療腦出血的研究減少，鑒于此，本文研究丁基苯酞對腦出血模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制，為臨床治療腦出血提供有效數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取50只健康雄性SD大鼠，6～10月齡，體重330～480 g，購自北京科奧力飼料有限公司，合格證號為京動(dòng)(2000)第015號。50只大鼠分籠飼養(yǎng)，按時(shí)更換墊料并給予飼料、飲水，溫度保持21～25℃，濕度保持在40%～50%。

1.2方法

1.2.1腦出血模型大鼠的建立 從50只大鼠中任意選取10只大鼠為正常組，其余40只大鼠參考鄭希院等〔7〕文獻(xiàn)中腦出血模型建立，使用400 mg/kg 10%的水合氯醛麻醉注射于大鼠腹部，將大鼠于立體儀上固定，剃除大鼠頭部體毛并于頭部正中做縱行切口，將骨膜剝離，充分顯露冠狀縫和前囟，鉆直徑>1.0 mm小孔于前囟前中線右側(cè)2 mm、中線右側(cè)3 mm處，抽取股動(dòng)脈50 μl血液在鉆孔處垂直進(jìn)針5 mm左右，注入抽取的股動(dòng)脈血，留針10 min后退出，使用消毒針縫合切口。大鼠腦橫斷面可見明顯血腫，血液沒有出現(xiàn)針道反流的情況，蛛網(wǎng)膜下腔無出血為建模成功，成功36只。

1.2.2分組和用藥 于建模成功6 h后將36只大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，各9只。低、中、高劑量組分別給予10、20、30 mg/kg的丁基苯酞，將其溶于大豆油中，每天進(jìn)行2次灌胃。正常組和模型組(9只)給予等體積的大豆油代替灌胃。

1.2.3大鼠腦組織蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 于最后一次給藥后5 h進(jìn)行麻醉，斷頭處死取其腦組織置于4℃冰箱中固定2 d；取出固定的組織，使用手術(shù)刀將其切成2 μm厚的樣品；將樣品經(jīng)乙醇梯度脫蠟至水，隨后放入Harris蘇木素染4～10 min，用純凈水清洗；迅速用1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分色，置于純凈水10～20 min；放入伊紅染液中染色3 min；常規(guī)脫水后封片，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率的檢測 采用流式細(xì)胞儀(北京德利卡生物科技有限公司)檢測大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞傳代至5孔板，將0.25%胰蛋白酶加入進(jìn)行消化，1 500 r/min的離心機(jī)處理10 min海馬區(qū)細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，于避光常溫處將離心的海馬區(qū)細(xì)胞收取，加入5 mg/L Hoechst33258染色10 min，60 min后用特異熒光標(biāo)記，用鞘液包裹，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀操作說明進(jìn)行檢測。

1.2.5腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分的測定 (1)使用干濕質(zhì)量法檢測腦組織含水量：分別測量(精度0.1 mg的電子天平)各組大鼠腦組織濕重，隨后放置于100℃的恒溫干燥箱進(jìn)行1 d的烘焙，腦組織不再減輕后暫停，測量大鼠腦組織質(zhì)量。(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕重×100%=腦組織含水量。(2)參考彭璇等〔8〕文獻(xiàn)中介紹的方法，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置，記錄大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評分。大鼠在Morris水迷宮中的訓(xùn)練6 d后，于第7天將時(shí)間均值記錄下來，為最終測定效果。(3)采用Longa評分方法評定大鼠神經(jīng)功能，無任何體征為0分；大鼠前肢不能全部伸直為1分；大鼠一側(cè)肢體癱瘓且有追尾現(xiàn)象為2分；大鼠不能站立、不能打滾為3分；有意識障礙且無自發(fā)性活動(dòng)為4分。

1.2.6大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的檢測 應(yīng)用Western印跡法測定高遷移率族蛋白(HMGB)1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、半胱天冬酶(Caspase)3、B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)的X基因(Bax)表達(dá)。RIPA緩沖液提取總細(xì)胞裂解物，配置12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,恒壓80 V,2 h)，將蛋白質(zhì)分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，密封于5%脫脂奶粉中,并在4℃下與一抗孵育過夜。用緩沖液洗膜，作用15 min，重復(fù)3次。孵育膜與二抗，于5℃中作用120 min，然后涂上發(fā)光劑，曝光并掃描。采用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，參照蛋白為β-actin。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差齊性比較、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腦組織HE觀察 如圖1所示，正常組神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞均正常；模型組腦出血組織細(xì)胞間隙增加、神經(jīng)細(xì)胞固縮及膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加、體積擴(kuò)大；低、中、高劑量組腦組織的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞體積增大，炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞體積增大等情況有所緩解；高劑量組較低、中劑量組腦組織排列規(guī)范，膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞體積增大等情況明顯減退。

2.2大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況 正常組細(xì)胞低強(qiáng)度熒光呈現(xiàn)均勻，細(xì)胞核橢圓形或圓形，邊緣清晰；模型組凋亡細(xì)胞顯著增多，表現(xiàn)為亮藍(lán)色熒光核濃染致密，呈固縮形態(tài)，部分出現(xiàn)顆粒熒光、核小體破裂；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，經(jīng)丁基苯酞干預(yù)后凋亡細(xì)胞減少，且隨著丁基苯酞的劑量增大，其抑制細(xì)胞凋亡的效果增強(qiáng)。見圖2。

圖1 各組腦組織(HE染色，×400)

圖2 各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.3各組腦組織HMGB1、VEGF蛋白表達(dá)的比較 如圖3、表1所示，與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達(dá)升高，VEGF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達(dá)顯著降低，VEGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達(dá)顯著降低，VEGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達(dá)降低，VEGF蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分的比較 如表1所示，與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1～5:模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、正常組；圖4同圖3 各組HMGB1、VEGF蛋白表達(dá)

表1 各組腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分、HMGB1及VEGF蛋白表達(dá)比較

2.5各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的比較 如表2、圖4所示，與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著升高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)均升高，Bax蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的比較

圖4 各組Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

3 討 論

腦出血是一種臨床比較常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，在全部腦卒中患者中，腦出血患者占20%～30%〔9〕。有報(bào)道稱，腦出血發(fā)生的主要原因與糖尿病、高脂血癥、高血壓、血管老化等密切相關(guān)〔10〕。據(jù)相關(guān)報(bào)道〔11〕，中老年人群和高血壓患者發(fā)生腦出血概率較高，且隨著我國日常生活質(zhì)量及人口老齡化現(xiàn)象的不斷升高，腦出血發(fā)病率、病死率、致殘率呈上升趨勢。腦出血病情嚴(yán)重、進(jìn)展快，常因情緒激動(dòng)、費(fèi)力用盡時(shí)突然發(fā)病，其發(fā)病后主要臨床表現(xiàn)為頭暈、頭痛及認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)、言語障礙等〔12〕。腦出血早期死亡率較高，幸存者中大多數(shù)患者均留有一系列后遺癥，嚴(yán)重影響身心健康及生活質(zhì)量〔13〕。

丁基苯酞具有多種藥理作用，其可通過降低花生四烯酸含量，升高腦血管內(nèi)皮一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)的水平，使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度降低，抑制氧自由基，減少谷氨酸釋放和改善抗氧化活性等機(jī)制達(dá)到抗腦缺血、減輕腦水腫、抗腦血栓形成和抗血小板聚集等作用〔14,15〕。動(dòng)物學(xué)研究表明〔16〕，采用Longa改良縫線閉塞法建立永久性大腦中動(dòng)脈鼻塞模型小鼠，觀察到丁基苯酞可升高VEGF表達(dá)，使血腦屏障通透性降低，改善腦梗死小鼠神經(jīng)功能缺損及腦水腫。在本文研究中，丁基苯酞可降低腦出血模型大鼠腦組織含水量、學(xué)習(xí)記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分，改善大鼠記憶功能及神經(jīng)功能，減少腦含水量。

HMGB1是目前為止僅有的能夠在細(xì)胞外誘導(dǎo)細(xì)胞因子活化及分泌炎癥細(xì)胞的核內(nèi)蛋白，在修復(fù)組織損傷等多種生理病理過程中具有重要作用。研究表明〔17〕，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、γ-干擾素(IFN-γ)等炎性細(xì)胞因子可刺激下單核-巨噬細(xì)胞釋放HMGB1，HMGB1也可刺激下單核-巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10、IL-6等炎癥介質(zhì)，參與調(diào)解遠(yuǎn)期的誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及免疫細(xì)胞應(yīng)答近期的損傷，加重局部水腫和滲出。VEGF是一種促血管生長因子，其通過與VEGF受體(VEGFR)-1、VEGFR-2等結(jié)合激活絡(luò)氨酸激酶，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、形成臨時(shí)基質(zhì)等一系列生物效應(yīng)，達(dá)到促進(jìn)血管生成的作用〔18〕。涂鄂文等〔19〕研究結(jié)果中，腦出血大鼠經(jīng)丁基苯酞干預(yù)后VEGF、血管生成素(Ang)-2蛋白表達(dá)上調(diào)，且丁基苯酞并未增加大鼠顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)。本文研究結(jié)果顯示，丁基苯酞可升高腦出血模型大鼠腦組織VEGF蛋白表達(dá)，降低HMGB1蛋白表達(dá)，減輕神經(jīng)功能缺損，增加大鼠出血周圍新生血管密度。

在臨床檢測細(xì)胞凋亡情況的蛋白中，Caspase3、Bcl-2、Bax較為常見，檢測Caspase3、Bcl-2、Bax表達(dá)能夠比較準(zhǔn)確地評價(jià)細(xì)胞的凋亡情況〔20〕。在Caspase家族中，Caspase3是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。Bcl-2、Bax屬于線粒體凋亡通路上的重要組成蛋白，吳曉光等〔21〕指出，干預(yù)腦出血大鼠可通過調(diào)控Bcl-2、Bax表達(dá)，達(dá)到抑制腦組織神經(jīng)死亡、起到腦保護(hù)的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，丁基苯酞可升高腦出血模型大鼠海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)，提示丁基苯酞可能通過調(diào)控Caspase3、Bcl-2、Bax的表達(dá)達(dá)到抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，丁基苯酞改善腦出血模型大鼠記憶功能及神經(jīng)功能，減少腦含水量，減輕神經(jīng)功能缺損，增加大鼠血腫部位新生血管密度，通過調(diào)控Caspase3、Bcl-2、Bax的表達(dá)達(dá)到抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。