基于P53、Bax、Caspase-3基因表達探討竹節參水提取物對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響

陳紅梅 馮強 黎娟 陳鐵民

(儋州市中醫醫院，海南 儋州 571700)

宮頸癌是較為常見的生殖器官癌癥〔1〕，其嚴重危害女性身體心理健康。目前，臨床宮頸癌治療以手術及放化療為主，但由于化療藥物的神經毒性、關節肌肉疼痛、脫發等毒副反應及耐藥問題，使其臨床應用受到了一定限制〔2〕。現階段，宮頸癌的發病年齡逐漸年輕化〔3〕，死亡率也日益見長〔4〕，這給宮頸癌的防范與治療帶來更大的挑戰。目前，越來越多的研究發現，中草藥在宮頸癌的治療中發揮著積極作用〔5〕。竹節參又名竹節三七、竹節人參、白三七，為五加科植物竹節參(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根莖,屬《中國藥典》多年收載的中藥材品種〔6〕。竹節參屬溫性藥材，味道甘中帶苦，能夠補腎益氣，還可以消散瘀滯、緩解疼痛、收斂止血、清肺化痰〔7,8〕，常用于大病初愈、產后虧虛、咳嗽上痰、跌打損傷者〔9〕。藥理學分析發現〔10〕，竹節參具有抗炎、延緩衰老、降血糖及抗腫瘤作用。皂苷是竹節參的主要活性成分(約占 23.6%)，且三萜類皂苷具有較高含量，具有解熱、抗菌、抗癌等生物作用。竹節參具有較低的毒副作用，臨床使用時不宜產生耐藥性，且對惡心腫瘤具有良好的療效〔11〕，但是其與宮頸癌的相關研究較少，作用機制也不明晰。本研究基于P53、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3基因表達探討竹節參水提取物對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1細胞、儀器 宮頸癌HeLa細胞；MCO-AC型CO2細胞培養箱；EPICS XL流式細胞儀；5910型高度冷凍離心機；Imagephoto圖像處理軟件；倒置熒光顯微鏡；PCR儀；DAPI staining solution。

1.2藥材 竹節參購自種植基地，經專家鑒定為正品。把竹節參的根莖烘干蒸發掉水分后進行碾壓，收集粉狀后加入純凈水回流提取3次，將獲得的濾液進行濃縮，即為竹節參水提取物，提取率為25.8%，加入達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)培養基依次制成0、50、100、150 μg/ml濃度，分別為A、B、C、D組。

1.3細胞培養 取第3代培養的宮頸癌Hela細胞，0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)進行消化，調整細胞濃度為1×105/ml，接種在96孔細胞培養板中，每孔100 μl，于37℃、5% CO2培養箱中至單層細胞。將 0、50、100、150 μg/ml濃度竹節參水提取物分別加入宮頸癌Hela細胞中(100 μl/孔)，每種質量濃度設置5個復孔，將培養板放置在37℃、5% CO2培養箱中，連續進行24 h培養。

1.4HeLa細胞增殖活力 取培養好的HeLa細胞，挪至96孔板，A、B、C、D組各添加10 μl相應劑量竹節參水提取物后加入噻唑藍(MTT)液，黑暗條件下靜置4 h后除培養基，加二甲基亞砜150 μl，震蕩后進行計算。

1.5HeLa細胞凋亡率 取A、B、C、D組細胞，消化后將細胞密度調至2 × 105ml，挪至96孔板，每孔200 μl，放入培養箱中24 h，滴加TUNEL檢測液(含TdT酶2 μl、熒光標記液48 μl)，避光孵育，熒光顯微鏡下觀察細胞情況，測定OD值，每張圖片取5個視野，在400倍下完成凋亡細胞核計數，獲得凋亡率。

1.6HeLa細胞周期 將生長良好的HeLa細胞濃度調整至1 × 105個/ml，接種至6孔板，24 h后更換培養基，48 h后加0.25%胰蛋白酶消化懸浮(無EDTA)，收集細胞。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，加3 ml乙醇(經-20℃預冷)，混勻后與-20℃冰箱靜置1 d。測定前離心10 min(1 500 r/min，PBS沖洗2次，重懸于200 μl 0.1 mmol/L EDTA 溶液中，30 min避光孵育后加入35 μl 2% Tritonx-100、114 μl 150 μg/ml碘化丙啶(PI)溶液，充分混合后避光反應10 min，測定細胞周期。

1.7HeLa細胞凋亡形態 A、B、C、D組細胞離心10 min后去除上層清液，加入10 g/L蘇木素-伊紅(HE)染色液，避光10 min后去除染液，PBS 洗滌2次后涂片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察形態。

1.8P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達 提取P53、Bax、Caspase-3 RNA，RT-PCR測P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達，引物序列P53：正義鏈5′-GCCAGTCTGATTTGTGGGCC-3′，反義鏈5′-GCCAGTTGTTTTTC TGCCAC-3′；Bax：正義鏈5′-GACTCCAAGCGCTGA GAATG-3′，反義鏈5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；Caspase-3：正義鏈5′-TCCAGGCCGTATAG ATCCTFFTACA-3′，反義鏈5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′；β-actin：正義鏈5′-GGCACAC TCCAAGCGCTGAG-3′，反義鏈5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。設定PCR條件為30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，連續進行35個循環，最后在72℃下完成10 min延長。擴增產物放入1.5%瓊脂凝膠中電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測定，以β-actin為內參。

1.9統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行F檢驗。

2 結 果

2.1HeLa細胞增殖活力及凋亡率 A、B、C、D組細胞增殖活力隨竹節參水提取物濃度增加而逐漸減弱(P<0.001)；A、B、C、D組細胞凋亡率隨竹節參水提取物濃度增加而逐漸上升(P<0.001)，見圖1、表1。

圖1 HeLa細胞凋亡率

表1 HeLa細胞增殖活力

2.2HeLa細胞周期 隨著竹節參水提取物的濃度增加，Hela細胞G0/G1期顯著增加，S期顯著下降(P<0.001)，見表2。

表2 Hela細胞周期變化

2.3HeLa細胞凋亡形態 A組未添加竹節參水提取物，HeLa細胞細胞核形態為卵圓狀，染色也較為均勻；B組添加竹節參水提取物后，部分HeLa細胞細胞核形態改變，出現縮小和濃縮現象，熒光現象也增強；C、D組細胞因提取物濃度增加，細胞核形態改變加劇，熒光亮度攀升，細胞核邊緣破碎，見圖2。

圖2 HeLa細胞凋亡形態(HE染色，×400)

2.4各組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達 P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達隨竹節參水提取物濃度增加而顯著增加(均P<0.001)，見表3，圖3。

表3 各組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達

圖3 各組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達

3 討 論

現階段，宮頸癌的發病率和死亡率逐漸攀升，患者也出現年輕化趨勢，呈現高患病率、高致死率和低治愈率的特征〔12〕。宮頸癌的發病機制較為復雜，與免疫功能低下、過早性行為、多個性伴侶、吸煙、多孕、多產等都有關。現階段，臨床常用的治療宮頸癌的手段還是手術，同時患者可能接受放療或化療治療，雖然對這種治療方式對宮頸癌患者起到了一定的效果，但也存在一些局限性，手術切除后，部分患者可能出現病情復發，無法徹底治愈，遠期生存率較低等問題，而放化療則會出現復副作用大，患者不耐受以及耐藥性等問題〔13〕。近年來，多數研究人員發現中藥對于腫瘤的預防和治療具有較好效果，且副作用小，所以，中藥治療宮頸癌成為研究人員的研究重點。竹節參在臨床常用于治療跌打損傷、身體虧虛、咳嗽咯痰患者，是一種常見的中藥材。相關文獻記載，竹節參對于多種癌癥具有較好的抑制作用〔14～16〕。除此之外，竹節參水提取物能抑制血管的形成，有助于增強機體免疫功能。有研究表明〔17〕，竹節參具有抗炎及潛在的抗腫瘤作用，其水提取物能顯著增強機體免疫水平，能抑制腫瘤細胞的生長。

本研究結果表明，HeLa細胞的增殖活力隨竹節參水提取物劑量的增加而降低，即竹節參水提取物的濃度越高，HeLa細胞的增殖活力越弱，這提示竹節參水提取物可以抑制HeLa細胞的增殖活力，王開元等〔15〕在竹節參的化學成分與藥理活性研究進展中也有提到，竹節參提取物可以抑制胃癌細胞的增殖，這與本研究結果相類似。本研究結果提示竹節參水提取物能夠誘導HeLa細胞凋亡，且其濃度越大，誘導HeLa細胞凋亡的能力越強，并且關于竹節參水提取物誘導癌細胞凋亡這一觀點，在張瑩等〔18〕關于竹節參與胃癌的研究中也有提到。本研究流式細胞儀測定結果說明竹節參水提取物多作用于細胞生長初期，這與劉瀅等〔19〕研究結果相一致。本文還通過HE染色觀察細胞形態，鏡下觀察發現，未經竹節參水提取物作用的HeLa細胞細胞核形態為卵圓狀，染色也較為均勻；而經竹節參水提取物作用后，HeLa細胞細胞核形態改變，濃度越高，縮小、濃縮、熒光現象越明顯，細胞核的染色質的凝聚增強，甚至部分細胞核邊緣化，裂解,出現凋亡小體，這在劉瀅等〔19〕研究中也有提及，證實了竹節參水提取物誘導細胞凋亡的作用。

細胞凋亡區別于細胞壞死，其過程不是被動的過程，而是主動的過程，多涉及基因的激活、表達與調控作用，是為了更好地適應生存而主動爭取的一種死亡過程〔20〕。而癌細胞是種變異的細胞，與正常細胞不同，它可以無限增殖、遷移、侵襲，破壞機體平衡，導致細胞凋亡紊亂，危害患者生命安全。P53是抑癌基因，其能夠促進癌細胞凋亡，阻止正常細胞發生癌變。但P53易發生突變，突變型P53起原癌基因的作用，抑制細胞凋亡并促進細胞惡性轉化〔21〕。Bax 基因是細胞凋亡的促進基因，也是機體內重要的凋亡基因。Caspase-3與細胞凋亡密切相關，其容易活化，在CTL細胞殺死中占據重要位置。本研究結果提示竹節參水提取物可以增加凋亡基因表達，推進腫瘤細胞凋亡進程。