苗藥五香血藤提取物對慢性非細菌性前列腺炎大鼠NF-κB P65、iNOS表達的影響

李章春 寧燕 李珀 梁子聰 楊政敏 孫海波

(1黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000;2貴州醫科大學)

慢性非細菌性前列腺炎(CAP)是臨床男科前列腺炎最常見的類型，占發病率的90%以上〔1〕，全球發病率為3%～16%〔2〕，在我國約占成年男性泌尿科門診疾病的33%〔3〕，患者臨床表現為尿急、尿頻、尿不盡等排尿異常，并伴隨腰骶部等酸賬不適，生活質量受到嚴重影響。然而，CAP的發病機制尚不十分明確，但免疫因素在CAP的發生與發展中發揮重要作用，已被眾多研究所證實，由于老年人群機體免疫能力下降，且前列腺增生的高發進一步加重了治療難度〔4〕。核因子(NF)-κB在免疫、炎癥反應中具有重要的調節性作用，與細胞因子關系密切，已成為當前研究疾病發病機制的一個熱點〔5〕。目前，CAP的治療方法主要是α1-受體阻滯劑、抗生素、非甾體類抗炎藥等，但此類藥物易造成頭暈、皮膚過敏、胃腸出血等不良反應，不宜長期服用，且治療效果也并不理想〔6〕。中醫藥以療效好，不良反應小的特點，逐漸成為CAP治療藥物研發的新方向〔7,8〕。五香血藤是貴州常用的民間苗藥，具有抗腫瘤、消腫鎮痛等功效〔9〕，但有關五香血藤治療CAP的研究卻鮮有報道，本文通過觀察五香血藤提取物對CAP大鼠NF-κB P65、iNOS蛋白表達的影響，進一步探究其治療CAP的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康雄性成年SD大鼠60只，體重200～220 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2019-0013。大鼠隨機分為正常組，CAP模型組、陽性藥物組、苗藥五香血藤提取物高劑量治療組(高劑量組)、中劑量治療組(中劑量組)、低劑量治療組(低劑量組)，每組10只，每籠5只，分籠飼養，自由取水、食，適應性喂養3 d。

1.2藥物試劑與儀器 干五香血藤購自貴州都勻市中藥材市場，廣西師范大學化學與藥學學院進行質控、鑒定和提取，方法：取五香血藤，粉碎，加入萃取釜中，80 L 80%的乙醇萃取3次，取浸膏備用；消痔靈注射液，國藥準字Z22026175,吉林集安益盛藥業股份有限公司；前列舒通膠囊，國藥準字Z20027140，保定天浩制藥有限公司。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-8水平，試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司，全自動酶標儀：Mindrady MR-96A。

1.3模型制備 根據文獻〔10〕方法，乙醚麻醉大鼠，仰位固定于消毒鋪巾，在下腹正中部位行切口，提起膀胱，找到兩側前列腺，將25%消痔靈注射液分別注入前列腺背葉內，各0.1 ml,逐層進行縫合，模型形成期7 d，7 d后開始給藥治療。

1.4給藥方法 參照文獻〔11〕換算，陽性藥物組給予前列舒通膠囊水溶液灌胃治療，劑量20 ml/kg；苗藥五香血藤提取物高、中、低劑量組分別給予252、126、63 mg/kg劑量灌胃；正常組和CAP模型組給予無菌生理鹽水灌胃，劑量同陽性藥物組，各組給藥1次/d，連續給藥28 d。

1.5實驗取材 末次給藥結束2 h后，稱取各組大鼠重量，股動脈取血，靜置，離心，取上清液備用。待處死大鼠后，置于操作臺剪下膀胱及前列腺，剔除脂肪和膀胱，濾紙吸干，稱重，同時取肝臟、脾臟、胸腺、腎臟等器官，并計算臟器指數(臟器指數=臟器質量/體重×100%)。

1.6標本處理 取大鼠前列腺組織，用4%的多聚甲醛進行固定，經常規的組織脫水、透明、浸泡、包埋、切片、脫蠟等處理，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下病理組織觀察分析。

1.7Western印跡檢測前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白表達 采用裂解法提取細胞總蛋白，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)將前列腺組織洗滌2～3次，細細剪碎組織置于勻漿管中，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量，各組取等量蛋白質經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉1 h，加入NF-κB P65(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜，0.5%TBST溶液洗膜，5 min/次，共3次，加入二抗，室溫下孵育30 min，0.5%TBST溶液洗膜，5 min/次，共3次，化學發光法顯色，ImageJ軟件分析灰度值，計算目標蛋白相對含量(即目的蛋白灰度值/β-actin內參蛋白灰度值)。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組前列腺指數比較 給藥結束后，與CAP模型組比較，除低劑量組外其余各組前列腺指數均明顯降低(P<0.05)；高劑量組與陽性藥物組差異性不顯著(P>0.05)，兩組前列腺指數逐漸接近正常組，見表1。

2.2各組前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白相對表達量比較 與正常組比較，其余各組前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)；與CAP模型組比較，除低劑量組NF-κB p65蛋白相對表達量，其余各治療組NF-κB P65、iNOS蛋白相對表達量均明顯降低(P<0.05)；與陽性藥物組比較，僅高劑量組與其差異性不顯著(P>0.05)，見表1、圖1。

2.3各組血清TNF-α、IL-6和IL-8含量比較 與CAP模型組比較，其余各組TNF-α、IL-6和IL-8含量均明顯降低(P<0.05)，與陽性藥物組比較，高劑量組血清TNF-α、IL-6和IL-8含量差異性不顯著(P>0.05)，且兩組含量逐漸接近正常組，見表1。

表1 各組前列腺指數、組織NF-κB P65、iNOS蛋白相對表達量及血清TNF-α、IL-6、IL-8含量比較

1～6:CAP模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，陽性藥物組，正常組圖1 Western印跡檢測前列腺組織NF-κB P65、iNOS蛋白表達

2.4各組肝、脾、腎臟器指數比較 與CAP模型組比較，陽性藥物組和高劑量組的肝臟指數和腎臟指數差異性顯著(P<0.05)，各組脾臟指數差異不顯著(P>0.05)；與陽性藥物組比較，高劑量組肝臟指數明顯升高(P<0.05)，而脾臟指數和腎臟指數差異不顯著(P>0.05)，見表2。

2.5各組前列腺組織病理學觀察 鏡下可見，正常組前列腺組織病理學觀察未見異常改變；CAP模型組前列腺組織內腺體上皮細胞明顯增生，間質內毛細血管充血，大量纖維組織增生，炎癥細胞浸潤明顯；低劑量組前列腺組織內仍可見腺體上皮細胞增生及較多的炎癥細胞浸潤，但其增生及浸潤的程度較模型組有所減輕；中劑量組前列腺組織的腺體輕度增生，間質內炎癥細胞數量減少，纖維組織增生緩解，較低劑量組有所減輕；高劑量組前列腺組織的腺體上皮細胞排列整齊，無明顯增生，纖維組織增生及炎癥細胞滲出病變明顯減輕，病理改變接近陽性藥物組，見圖2。

表2 各組臟器指數比較

正常組

CAP模型組

陽性藥物組

高劑量組

中劑量組

低劑量組

3 討 論

2016年，國務院頒發了《國務院關于印發中醫藥發展戰略規劃綱要(2016～2030年)的通知》(簡稱通知)〔12〕，強調要加強中醫藥科學研究，加強對常見病、多發病、慢性病的中醫藥防治研究，針對疾病新的藥物靶標，在中藥資源中尋找新的候選藥物。近年來，在CAP的藥物治療中，中醫藥因具有雙向調節、多靶點的特點，在減輕炎癥、緩解患者盆腔疼痛中發揮了重要作用〔13〕。五香血藤屬五味子科為木質藤本植物，具有理氣止痛、活血消腫等功效，主要活性成分是木脂素，有抗氧化、解熱、安定等作用，用于治療無名腫毒、咽喉腫痛、跌打損傷等〔14〕，但目前有關五香血藤藥物應用的基礎醫學研究還并不多見。本研究結果表明，五香血藤可能通過抑制NF-κB P65、iNOS蛋白表達，參與了CAP大鼠的炎癥調解。

NF-κB是一種基因轉錄調控蛋白，在細胞發育、促增殖、炎癥反應、腫瘤形成等免疫性疾病中具有廣泛的調節作用，是重要的信號通路〔15〕。通常情況下，NF-κB在正常細胞中處于失活狀態，它主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白(I-κB)結合，存在于胞質中，當細胞因子、活性氧等多種刺激，使I-κB被誘導磷酸化，p50/p65解離，使NF-κB活化，據研究顯示〔16，17〕，p65能夠與下游TNF-α、IL-6等靶基因結合，啟動相關子區域，使這些基因的轉錄水平被提高。在NF-κB與前列腺癌的相關研究中發現〔18〕，在前列腺癌形成期間NF-κB表達水平逐漸增加，腫瘤一旦形成NF-κB會表現出過度活化現象，前列腺癌的發病與慢性前列腺炎具有高度相關性〔19〕。一氧化氮合酶分為nNOS、iNOS、eNOS 3種亞型，其中iNOS和一氧化氮(NO)是NF-κB信號通路中兩種重要的信號轉導分子，構成了機體重要的氧化應激通路，即NF-κB/iNOS-NO信號通路，與炎癥損傷、氧化損傷關系十分密切，能夠放大炎癥反應級聯，激活炎癥介質趨化，使TNF-α、IL-1、IL-8等炎癥細胞因子表達釋放〔20，21〕。iNOS和前列腺炎的關系研究認為，氧化應激可能是Ⅲ型前列腺炎的重要發病因素之一〔22〕。本研究結果表明，五香血藤提取物能夠對CAP大鼠炎癥起到緩解作用。

綜上，苗藥五香血藤提取物能夠對CAP大鼠前列腺組織內NF-κB P65、iNOS蛋白的表達起到抑制作用，通過下調TNF-α、IL-6和IL-8含量，改善組織學損傷，降低炎癥水平。