補陽還五湯含藥血清對代謝相關脂肪性肝病細胞模型脂質沉積的作用

周凱旋 薛嘉寶 李麗靜

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

代謝相關脂肪性肝病(MAFLD)是由于代謝性因素所導致的脂肪在肝細胞沉積過度，在學術上曾稱為非酒精性脂肪性肝病，較多的發生于肥胖人員及糖尿病患者中〔1〕。Ⅱ型糖尿病是MAFLD發生的重要因素，通常這兩種疾病可以共存，相互影響，使疾病的發生發展進程加劇〔2，3〕，近幾年研究發現MAFLD與糖尿病、肥胖、高血壓等多種代謝性綜合征有著明顯的關系，肝臟是胰島素作用的主要靶器官，肝臟對血糖穩態的控制起著非常重要的作用，而MAFLD與糖尿病的共同病理特點是胰島素的抵抗〔4，5〕，有調查研究顯示，Ⅱ型糖尿病的患者有較高風險患MAFLD，若不能進行有效的控制治療，可進一步發展成脂肪性肝炎、肝硬化，患者的生命健康會受到較為嚴重的影響〔6，7〕。在中醫理論中的“消渴病”既是現代臨床常說的糖尿病，而脂肪肝通常認為是“肥氣病”“痰證” “脅痛”等中醫藥理論的范疇〔8〕，二者病因具有共同點，多為飲食不節、嗜食肥甘厚味、勞逸失度、情志失調所引起機體代謝失調，進而誘發疾病〔9〕，補陽還五湯是益氣活血法的代表方，臨床有較多案例將其應用于治療糖尿病及其并發癥〔10，11〕，補陽還五湯對血脂、膽固醇具有良好的降低作用。本研究探討補陽還五湯對代謝相關脂肪性肝病細胞模型脂質沉積的調節作用。

1 資料與方法

1.1動物 雄性SD大鼠8只，重量180～220 g，SPF級，購于遼寧長生實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(遼)-2015-0001。

1.2細胞 人肝癌細胞(HEPG)2由國家實驗細胞資源共享平臺提供，培養于37℃，5%CO2的恒溫細胞培養箱中，細胞培養液條件為10%胎牛血清的DMEM高糖培養液。

1.3試劑與儀器 油酸標準品(A1802058，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；CCK-8試劑盒(KR675，日本同仁化學研究所)；胎牛血清(1861242，Gibco)；DMEM高糖培養基(AF29449021，Hyclone)；油紅O染色液(20200710，南京建成生物工程研究所)；三酰甘油(TG)檢測試劑盒(20200708，南京建成生物工程研究所)；磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)多抗隆抗體(67121-1-Ig，武漢三鷹生物)；β-肌動蛋白(Actin)多克隆抗體(66009-1-Ig，武漢三鷹生物)；蛋白激酶B(AKT)多克隆抗體(10176-2-AP，武漢三鷹生物)；核因子(NF)-κB多克隆抗體(10745-1-AP，武漢三鷹生物)；Beclin-1多克隆抗體(11306-1-AP，武漢三鷹生物)；Caspase-3多克隆抗體(19677-1-AP，武漢三鷹生物)；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗(SA00001-1，武漢三鷹生物)；HRP標記羊抗兔二抗(RS0002，Immunoway)；超敏化學發光(ECL)檢測試劑盒(B2202008，武漢三鷹生物)；酶標儀(EPOCH，Bio Tek)；熒光倒置顯微鏡(IX73，Olympus)。

1.4補陽還五湯含藥血清制備 根據人鼠藥物劑量換算關系表，補陽還五湯以70 kg成人每日劑量140 g，換算200 g大鼠劑量為140 g×0.018=2.52 g，再經換算得大鼠每日臨床等效劑量為12.6 g/kg。動物適應性飼養3 d后，分為空白組4只，補陽還五湯低劑量和高劑量組各2只，以補陽還五湯的大鼠臨床等效劑量12.6 g/(kg·次)及2倍臨床等效劑量25.2 g/(kg·次)灌胃給藥，早晚各灌胃1次，連續3 d，末次給藥1 h后，腹主動脈采血，以3 000 r/min離心10 min，分離血清經56℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝凍存于-80℃冰箱備用。

1.5油酸儲備液配置 將油酸標準品加到99℃預熱的氫氧化鈉溶液中皂化，再10%牛血清白蛋白(BSA)溶液1∶1混合，即為50 mmol/L的油酸儲備液，使用0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝，凍存-20℃冰箱備用。

1.6油酸對HEPG2細胞毒性實驗 調整細胞密度3×104個/孔，接種于96孔板，油酸設置濃度梯度為50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L，每組設置6個復孔，給藥24 h后，使用CCK8于450 nm檢測吸光度(OD值)，計算細胞增殖活性，確定誘導細胞脂肪變的油酸濃度。

1.7補陽還五湯對脂肪變HEPG2細胞脂質沉積的作用

1.7.1細胞分組 細胞分為正常組(Nor組；含10%空白大鼠血清的DMEM高糖培養液)，模型組(Mod組；10%空白大鼠血清+100 μmol/L油酸的DMEM高糖+)，補陽還五湯低劑量(BHL組；10%補陽還五湯低劑量大鼠血清+100 μmol/L油酸的DMEM高糖培養液)，補陽還五湯高劑量(BHH組；10%補陽還五湯高劑量大鼠血清+100 μmol/L油酸的DMEM高糖)。

1.7.2細胞TG檢測 按上述分組，每組5個復孔，細胞處理24 h后，棄掉舊培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次后加PBS 0.2 ml刮取細胞，冰水浴條件下超聲破碎，使用TG試劑盒檢測TG含量，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，最后以每克蛋白濃度校正TG含量，單位為mmol/gprot。

1.7.3油紅O檢測脂質沉積 細胞處理24 h后，棄掉舊培養基，使用PBS洗3次，加入新配制的油紅O溶液染色15 min。染色完成后加入PBS清洗細胞3次，加入水性封固劑，在顯微鏡下觀察。

1.7.4Western印跡檢測細胞PI3K、AKT、Beclin-1、NF-κB、Caspase-3蛋白表達 細胞總蛋白提取后使用BCA法測定蛋白濃度，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳，70 V、30 min濃縮膠電泳，110 V、60 min分離膠電泳。電泳結束后75 V恒壓濕轉80 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜3次，二抗孵育1 h，洗膜3次，ECL發光法進行曝光。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1油酸對HEPG2細胞的毒性 與正常組(0.83±0.05)比較，隨著油酸50、100、200、400、800 μmol/L濃度升高，細胞的增殖活性逐漸降低(OD值分別為0.80±0.08、0.79±0.07、0.77±0.08、0.77±0.03、0.60±0.05，P<0.05,P<0.01)，結合顯微鏡下進行觀察，在200 μmol/L濃度條件下，細胞內的脂質沉積顆粒較多，細胞形態嚴重變形，為防止后續實驗中藥物對嚴重損傷的細胞無法徹底發揮治療作用，故選擇100 μmol/L的油酸濃度進行后續造模。見圖1。

2.2對細胞內TG含量影響 與Nor組〔(0.13±0.01)mmol/gprot〕相比，Mod組的TG明顯增高〔(0.25±0.04)mmol/gprot,P<0.01〕，BHL、BHH組〔(0.23±0.02)、(0.18±0.01)mmol/gprot〕對TG均有降低作用，其中BHH組降低具有統計學差異(P<0.05)。

2.3對細胞內脂質沉積的影響 與Nor組相比，Mod組的脂質沉積增高，BHL、BHH組的脂質沉積均有降低，其中BHH組降低作用較好，見圖2。

2.4對細胞PI3K、AKT、Beclin-1、NF-κB、Caspase-3蛋白表達影響 與Nor組相比，Mod組PI3K、AKT、Beclin-1蛋白表達明顯降低，NF-κB、Caspase-3表達明顯升高(均P<0.05)，與Mod組比較，BHL、BHH組PI3K、AKT、Beclin-1蛋白表達明顯升高，NF-κB、Caspase-3表達明顯降低，其中BHH組作用較好，見表1、圖3。

圖1 顯微鏡下觀察細胞形態變化(×400)

圖2 補陽還五湯含藥血清對脂肪變HEPG2脂質沉積的影響(油紅O染色，×400)

表1 補陽還五湯含藥血清對蛋白表達的影響

圖3 補陽還五湯含藥血清對蛋白表達的影響

3 討 論

PI3K與多種細胞功能相關，包括細胞生長、增殖、分化、遷移和細胞內運輸，是胰島素信號通路的關鍵組成部分〔12〕，AKT是PI3K-AKT信號通路的主要的下游分子，包括3種亞型：AKT1、AKT2和AKT3，其中AKT1在多種組織中普遍表達〔13〕，研究顯示，激活PI3K-Akt通路，可明顯改善高脂飲食動物的血脂及肝臟的病理變化〔14〕。NF-κB是一種快反應轉錄因子，由p50/p65構成的異二聚體，可被包括PI3K-AKT信號通路的多種因素所調控〔15〕，臨床研究表明，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者NF-κB的活性亦明顯上升，提示NF-κB在NASH的損傷過程中扮演了重要角色，這其中的發病機制可能是因為NASH病程中出現脂質過氧化，激活了NF-κB〔16〕，NF-κB是一種具有多向性調節作用的蛋白質因子，不僅可介導腫瘤壞死因子α及白細胞介素6等多種炎性遞質轉錄表達，還通過調控凋亡相關蛋白表達參與細胞凋亡的調控〔17〕。自噬是細胞利用溶酶體降解身受損細胞器和大分子物質的過程，是一種調節良好的細胞內代謝機制，以維持細胞在壓力下的生存〔18〕，肝臟富含溶酶體，并具有高水平的代謝應激誘導自噬，它參與代謝相關脂肪性肝病的發生發展，脂質可通過選擇性自噬(稱為脂噬細胞)分解，肝細胞自噬發生障礙可以引起氧化應激和炎癥的增加，導致肝臟疾病的進一步發展〔19,20〕。Beclin-1可以介導自噬體膜的形成，該蛋白與PI3K和Akt發生相互作用，提高機體的自噬水平〔21〕，通過提高自噬水平，可以達到對MAFLD的治療作用〔22〕。

本研究表明補陽還五湯可以通過調節PI3K-AKT信號通路，影響肝細胞內的炎癥反應，調節細胞的凋亡。本研究通過實驗研究，證實了補陽還五湯對代謝相關脂肪性肝病的治療潛力，也為中藥的降脂新藥研發提供了一定的思路。