雄激素對乳腺癌細胞增殖的影響

陳月 徐丹

(1北華大學，吉林 吉林 132011；2北華大學附屬醫(yī)院)

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的主要原因〔1〕。在全球161個國家中，乳腺癌居女性癌癥發(fā)病率和死亡率的首位，同樣居于我國女性惡性腫瘤發(fā)病率首位〔2〕。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的雌激素依賴性惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高，據(jù)中國腫瘤登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國女性每年新發(fā)乳腺癌約24.9萬例，位居城市女性惡性腫瘤的首位〔3〕。性激素在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色，有研究表明，增加女性接觸卵巢激素的因素同樣也會增加其患乳腺癌的風險〔4〕。而激素致癌的機制實際上就是細胞增殖的增加，從而增加了基因突變累積的機會〔5〕。初潮年齡早、未生育及絕經(jīng)年齡晚都會增加患乳腺癌的風險〔6〕，此外，激素的替代療法也會增加患乳腺癌的風險〔7〕，而母乳喂養(yǎng)和生育期則具有保護作用。盡管流行病學研究強烈支持雌激素在絕經(jīng)后乳腺癌中的病因?qū)W作用，但雌激素在絕經(jīng)前乳腺癌中的作用尚不清楚〔8〕。

雌激素同樣在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中也扮演著重要的角色，其中終生接觸雌激素的增加或許是許多乳腺癌發(fā)生發(fā)展危險因素中最有依據(jù)的解釋。乳腺癌的發(fā)生與內(nèi)源性類固醇有關〔9〕。乳房是對雌激素敏感的器官〔1〕，雌激素可以促進乳腺腫瘤的發(fā)展和生長〔10〕。雌二醇(E2)，是由雌酮(E1)的還原和(或)睪酮(T)的芳構(gòu)化形成的〔11〕。雄激素由卵巢和腎上腺分泌，它們構(gòu)成了女性一生中占主導地位的性類固醇激素，雄激素可以作為雌激素前體，它們還可以通過與大多數(shù)乳腺癌標本中存在的雄激素受體結(jié)合來直接作用于乳腺癌細胞〔12〕。雄激素種類較多，如T、雙氫睪酮(DHT)及脫氫表雄酮等，具有生物活性的主要為T和DHT〔13〕。研究表明，T通過其兩種活性代謝物之間的平衡相互作用控制乳腺上皮生長：E2促進細胞增殖，而DHT抑制細胞增殖〔14〕。雄激素作為調(diào)節(jié)機體正常活動的重要物質(zhì)，具有多種重要的生物學功能，其表達與乳腺癌有著密切的聯(lián)系。雖然雌激素在乳腺癌病因?qū)W中的作用已被證實，但雄激素在乳腺癌發(fā)展和進展中的作用尚不清楚。目前的理論認為雄激素可以抑制乳腺癌細胞的生長，這種作用是通過雄激素受體所介導的〔15〕。目前，國內(nèi)外針對雄激素在不同濃度對乳腺癌細胞的增殖是抑制還是促進、在不同濃度雄激素環(huán)境下是否可以抑制乳腺癌細胞的增殖之間的關系研究鮮有報道。而許多關于雄激素對乳腺癌影響的體外研究都是在低濃度雌激素的存在下進行的，這使結(jié)果的解釋復雜化了。本研究中，給予的條件是在嚴重缺乏雌激素的情況下，雄激素對乳腺癌細胞增殖的影響。在這樣的條件下檢查雄激素的作用可能更加具有臨床意義。本文對不同濃度下雄激素對乳腺癌細胞增殖的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) MCF-7細胞購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，在DMEM低糖培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)于37℃、95%空氣和5%CO2培養(yǎng)箱。細胞培養(yǎng)液在添加到細胞培養(yǎng)基之前，通過用2%葡聚糖包被的活性炭(Sigma，St.Louis，MO，USA)處理FBS并在4℃過夜，消除血清中的外源性激素。

1.2不同濃度雄激素的制備 選用T及DHT粉末，根據(jù)其分子量，首先溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配備1個高濃度備用，再用無水乙醇稀釋到所需的不同濃度。DHT濃度分別為：0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L。T濃度分別為：0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L，待需要時加入培養(yǎng)孔中。

1.3細胞增殖 通過CyQuant細胞增殖試劑盒(Molecular Probe，Eugene，OR，USA)測定細胞增殖。將MCF-7細胞(3×103)接種到含有100 μl活性炭處理的無激素培養(yǎng)基的96 孔板上，48 h后分別給予0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L濃度的DHT及0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L濃度T加入培養(yǎng)液中，每組設5個復孔，加入0.0 nmol/L DHT及加入0.0 nmol/L T的細胞被認定為無激素組。細胞培養(yǎng)基每2 d更換一半。第4天，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌板并在-80℃下冷凍。

通過CyQuant細胞增殖試劑盒確定細胞增殖測定培養(yǎng)板在室溫下解凍，在避光條件下在每孔中加入200 μl的 CYQUANT GR染料/細胞裂解緩沖液添加到每個孔中，然后輕輕混合，室溫條件下孵育2～5 min。在使用裝有基于Excel的細胞增殖軟件的 Genios Plus(激發(fā)光480 nm，發(fā)射光520 nm)中讀板。

1.4細胞活力測定 通過使用噻唑藍(MTT)測定細胞活力。將3×103個細胞接種在96孔板中并孵育24 h。然后分別加入濃度為0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L DHT及0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L濃度T一起孵育。處理4 d后，每孔加入10 μl MTT試劑，將細胞在37℃下孵育2～4 h，直至出現(xiàn)紫色沉淀，然后加入100 μl洗滌試劑。將板在室溫下在黑暗中放置過夜，并使用讀板器在570 nm處記錄吸光度。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1雄激素對細胞增殖表達的影響 DHT 0.0 nmol/L組和T 0.0 nmol/L組為無激素影響對照，加入不同濃度DHT和T均對細胞增殖有影響。隨著雄激素濃度升高細胞增殖也隨之變化， DHT 0.8、1.2、1.6、2.0 nmol/L組與DHT 0.0 nmol/L組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)， DHT 1.6 nmol/L組DNA濃度表達量最低，抑制作用最明顯。T 2.0 nmol/L組DNA濃度與T 0.0 nmol/L組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示隨著T濃度的升高,T抑制細胞增殖的作用更加明顯。見表1、表2。

2.2雄激素對細胞活力表達的影響 DHT 1.6 nmol/L組細胞活力較DHT 0.0 nmol/L組顯著下降 (P<0.05)，且吸光度最低。T 0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L組細胞活力與T 0.0 nmol/L組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，T 2.0 nmol/L組吸光度值最低，表明雄激素發(fā)揮的抑制作用最明顯。見表1、表2。

表1 DHT對細胞增殖及細胞活力表達的影響

表2 T對細胞增殖及細胞活力表達的影響

3 討 論

雄激素是人體內(nèi)必不可少的一種性激素，屬于類固醇激素，是人體內(nèi)生物活性的蛋白質(zhì)，一般是指男性睪丸所產(chǎn)生的激素，而女性體內(nèi)的雄激素則主要是卵巢和腎上腺皮質(zhì)分泌，絕經(jīng)前女性體內(nèi)的五種主要雄激素(根據(jù)血清濃度降序排列)分別是硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)、脫氫表雄酮(DHEA)、雄烯二酮、T和DHT〔16〕。DHEAS僅由腎上腺產(chǎn)生〔17〕，而DHEA則是通過硫酸酯酶(30%)將DHEAS外周轉(zhuǎn)化，在腎上腺(50%)、卵巢(20%)和其他地方產(chǎn)生〔18〕雄烯二酮由卵巢和腎上腺等量產(chǎn)生的。大約一半的T來自雄烯二酮的外周轉(zhuǎn)化，剩下的一半由腎上腺和卵巢合成。在絕經(jīng)前婦女中，雌激素來自卵巢和脂肪組織，在黃體期產(chǎn)生的卵巢雌激素相對多于卵泡期〔19，20〕。E2是絕經(jīng)前婦女循環(huán)雌激素的主要類型，主要由卵巢分泌〔21〕。雄激素其主要通過與雄激素受體結(jié)合而發(fā)揮作用，其主要功能是促進性器官的生長發(fā)育和第二性征出現(xiàn)，維持正常生殖功能。雄激素在調(diào)節(jié)女性生殖功能中也起著重要的作用，它們對卵巢功能和生育能力具有協(xié)調(diào)作用，對顆粒細胞和卵母細胞的刺激有利于卵泡發(fā)育〔22，23〕及在調(diào)節(jié)卵泡成熟的所有階段都是必不可少的〔24〕。其中在乳房和其他組織中芳構(gòu)化成E2和E1，成為雌激素的重要來源〔21，25〕。E1似乎是雌激素絕經(jīng)后循環(huán)的主要形式。在一項對絕經(jīng)后婦女的9項前瞻性研究的匯總分析中，Key等〔26〕報告了隨著循環(huán)性激素水平(包括E2、硫酸雌酮、雄烯二酮、DHEA和T)的增加，乳腺癌的風險也在增加〔26〕。研究表明，循環(huán)雄激素水平，與乳腺癌風險增加有關，雄激素可直接通過促進細胞生長和增殖，或間接通過其芳構(gòu)化成雌激素發(fā)揮作用。盡管雄激素有擴增的原因，但是雄激素在細胞增殖中也起著至關重要的作用〔27〕。對絕經(jīng)后婦女的臨床研究表明，乳腺癌的發(fā)病率與循環(huán)雄激素水平〔28～31〕及與E2和T水平升高呈正相關〔29，32〕。

本研究結(jié)果表明，不同濃度的雄激素對MCF-7乳腺癌細胞株的增殖作用有所不同，當DHT濃度為1.6 nmol/L時及T濃度為2.0 nmol/L時可明顯抑制MCF-7乳腺癌細胞株的增殖。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雄激素T和DHT在沒有雌激素的情況下仍然可以誘導MCF-7細胞生長，并且乳腺癌細胞也能表現(xiàn)出較高的增殖現(xiàn)象。事實上，雄激素對乳腺細胞并非僅具有單一的抗增殖作用，可能是由于這幾種機制導致雄激素對乳腺細胞增殖的影響，其中包括雄激素轉(zhuǎn)化為DHT(5α-還原酶途徑)，DHT的下游代謝產(chǎn)物為5α-3β二醇是由3β-羥類固醇脫氫酶(HSD)作用產(chǎn)生的〔33〕，3β二醇在乳腺癌細胞中具有雌激素作用，它能激活雌激素受體(ER)α誘導生長和ER信號所導致，或E2(芳香酶途徑)、腎上腺雄激素(包括T和雄烯二酮)通過芳香化酶(CYP19)外周轉(zhuǎn)化產(chǎn)生從而雌激素，或者是它們與雄激素受體(AR)和(或)ER結(jié)合，雄激素信號使用5α-還原酶途徑，能夠控制由AR介導的細胞增殖〔34〕。研究表明，缺乏雌激素的乳腺癌細胞上調(diào)了激素生成酶，并將雄激素代謝為雌激素樣類固醇，而雌激素樣類固醇的產(chǎn)生代表了對芳香化酶抑制劑的一種潛在的耐藥性機制〔33〕。Omoto等〔35〕研究發(fā)現(xiàn)，當敲除雌性小鼠氧固醇7α羥化酶( CYP7B1，負責消除 3β二醇)時，小鼠乳腺和其他生殖組織表現(xiàn)出增殖升高及青春期早發(fā)和卵巢早衰，這更加印證了3β二醇在乳房和生殖組織中確實具有雌激素作用〔35〕。因此，可知雄激素信號在乳房穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用，它不僅可以抵消乳房中雌激素信號的增殖作用，而且當雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素(芳香酶途徑)時，也會增加細胞增殖和乳腺癌發(fā)生的風險〔34〕。

綜上，人體內(nèi)雌雄激素代謝是一個復雜的通路，需要各種激素相互協(xié)同、拮抗起作用，雖然本研究可以看出雄激素在特定濃度下能夠抑制乳腺癌細胞增殖，但仍無法明確將雄激素尤其是DHT確定為抑制乳腺癌細胞增殖的作用。