miR-21通過調節TGF-β/activin信號通路影響人骨髓間質干細胞向成骨細胞分化的機制

劉暉 李熙 吳學軍 林妙闊

(廈門大學附屬福州第二醫院，福建 福州 350000)

骨髓間質干細胞(BMSCs)具有廣義上干細胞的特征，自我增殖能力強，能夠進行多向分化為成骨細胞、心肌細胞、神經細胞等〔1,2〕。在醫學領域經常會有骨缺損的情況發生，骨組織工程的進步為患者的這一病癥提供了良好的解決方式〔3,4〕，尤其是其中的干細胞療法成為現階段的新興研究方向。微小RNA〔5〕(miRNA)是一種特屬于真核細胞中的內源性的非編碼RNA，長度僅僅在20個核苷酸左右，具有特異性識別靶基因3′端非翻譯區的功能，在細胞的新陳代謝等病理生理中起著不可或缺的調控作用〔6,7〕。而miR-21也與多種生物學過程密切相關，具有調控細胞新陳代謝、血管再生、成骨分化等作用〔8,9〕。轉化生長因子(TGF)-β是一種具有多種功能的細胞因子，主要調控細胞的生長，在成骨細胞的分化中也具有重要作用〔10〕。本研究以TGF-β/激活蛋白(activin)信號通路為基礎，探討miR-21對BMSCs分化為成骨細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑 胎牛血清(貨號10270-106，上海昱都生物科技有限公司)，低糖型DMEM培養基、Li-pofectamineTM2000(Thermo Fisher)，miR-21模擬物(mimics)、miR-21抑制劑(inhibitor)由諾揚生物技術公司合成，青霉素、鏈霉素(貨號BJ016251、BJ016332，上海邦景實業有限公司)，pmirGLO載體(貨號LM1439，上海聯邁生物工程有限公司)、雙熒光素酶報告基因試劑盒(貨號ab228530，英國Abcam公司)，MTT檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、DNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(貨號11465007001、23225、10503027、18091050，美國Sigma公司)，引物由上海江林生物科技有限公司提供。

1.2細胞

1.2.1BMSCs的分離及培養 骨髓由健康獻髓者捐贈，使用L-DMEM對采集的抗凝骨髓按照1∶5的比例稀釋，然后使用Percoll分離液對其進行分離。具體步驟：首先在試管底部加入1.073 g/ml的Percoll分離液，然后將處理后的骨髓通過1∶1的比例緩慢滴加進試管，以2 800 r/min的條件對其離心30 min，得到的單個核細胞使用L-DMEM洗滌兩次后在含有10%胎牛血清的L-DMEM培養基中進行培養，培養時使用24孔板，規定濃度為2.0×105/cm2，放置于37℃，含有5%CO2的培養箱中，2 d后將非貼壁細胞清除，其余細胞置于新鮮的培養基中，在細胞擴增到瓶底的90%融合時，使用0.05%的胰蛋白酶分解，并按照1∶1的比例對其進行傳代，傳代至2代以1∶2的比例進行傳代培養。

1.2.2轉染及分組 將培養的BMSCs細胞分為無轉染的空白對照組，轉染miR-21 mimics的BMSCs組、轉染有miR-21 inhibitor的miR-21敲低組。將生長程度為70%～80%融合度的細胞接種到細胞瓶中，再使用Li-pofectamineTM2000并按照其說明書來進行轉染，這樣進行2 d后將細胞培養液倒清，細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，后使用細胞裂解液進行細胞裂解。

1.3實驗方法

1.3.1miR-21靶基因預測 聯合TargetScan和miRanda兩個網站對miR-21的靶基因進行探找，最終選擇TGF-β/activin信號通路上miR-21的靶基因：TGF-β受體Ⅱ(TGF-βR2)、TGF-β1(activin)。

1.3.2RT-PCR檢測相關基因 通過Trizol法對總RNA進行提取，具體的操作按照說明書進行，然后將其進行純化定量，再按照逆轉錄試劑盒中的說明書步驟合成互補DNA，在RT-PCR試劑盒的步驟要求下對miR-21、TGF-βR2、TGFβ1、骨特異性轉錄因子(Runx)2、成骨細胞特異基因(Osterix)mRNA的表達情況進行檢測，以U6和GAPDH作為內參，使用2-△△Ct公式對它的表達情況進行分析。

1.3.3Western印跡檢測相關蛋白 使用裂解液裂解細胞，將裂解的細胞置于EP管中進行離心，離心條件為：12 000 r/min，4℃，15 min，然后收集上清液，根據BCA法檢測TGF-βR2、TGF-β1、Runx2、Osterix蛋白表達，從而可以通過BandScan5.0對得到的目的蛋白條帶進行分析。

1.3.4成骨細胞的鑒定

1.3.4.1鈣沉積檢測 細胞經miR-21過表達或敲低后21 d后使用PBS洗滌兩次后加入適當的茜素紅S染液進行滴染，維持3～5 min，于顯微鏡下對染色結果進行觀察。

1.3.4.2堿性磷酸酶(ALP)活性測定 按照ALP測定試劑盒的步驟，于細胞轉染miR-21后的第0、3、6、9、12、15、18、21天對其ALP活性進行檢測。

1.3.4.3骨橋蛋白(OPN)檢測 合成cDNA后對PCR進行擴增，通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后通過EB得出顯色結果。

1.4統計學分析 利用SPSS24.0進行單因素方差分析，多組內采用LSD-t兩兩比較，Pearson分析相關性。

2 結 果

2.1miR-21轉染對TGF-β1及TGF-βR2的影響 如表1所示，與空白對照組相比， miR-21過表達組中TGF-β1與TGF-βR2 mRNA的表達均顯著上升(P<0.05)，而miR-21敲低組中TGF-β1與TGF-βR2 mRNA的表達顯著降低(P<0.05)。miR-21與TGF-β1、TGF-βR2均呈正相關(r=0.568，P<0.05；r=0.627，P<0.05)。

2.2過表達miR-21可能增強TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表達 如圖1、表2所示，與對照組相比，miR-21過表達組TGF-β1與TGF-βR2蛋白的表達明顯上升(P<0.05)，miR-21敲低組TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。

表1 miR-21轉染后miR-21、TGF-β1及TGF-βR2 mRNA的表達

圖1 TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表達情況

表2 miR-21轉染后 TGF-β1、TGF-βR2的蛋白水平

2.3成骨細胞的鑒定結果

2.3.1鈣沉積檢測 如圖2所示，miR-21過表達組轉染21 d后染色通過顯微鏡觀察可見染液與鈣鹽結合后成的橘色物質，已形成鈣沉淀。

圖2 成骨細胞的鈣沉淀(茜素紅S染色，×200)

2.3.2ALP活性檢測結果 與空白對照組及miR-21敲低組相比，miR-21過表達組15 d、21 d ALP活性增高較明顯(P<0.05)。見表2。提示過表達miR-21可能能夠促進BMSCs向成骨細胞分化。

2.3.3OPN檢測 如圖3所示，將所獲取的PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行測定，可以發現，其產物擴增后約為320 bp。

M：標準marker；1、2：空白對照組；3、4：過表達miR-21組；5、6：敲低miR-21組圖3 OPN的瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.4成骨細胞相關基因及蛋白的表達 如表3、表4及圖4所示，miR-21過表達組中Rumx2與Osterix基因及蛋白的表達較空白對照組顯著上升(P<0.05)，而miR-21敲低組中成骨細胞Rumx2與Osterix基因及蛋白的表達較空白對照組和miR-21過表達組顯著降低(P<0.05)。miR-21與成骨細胞相關基因Rumx2、Osterix均呈正相關(r=0.627，P<0.05；r=0.516，P<0.05)。

表3 成骨細胞相關基因Rumx2與Osterix mRNA的表達

表4 miR-21轉染后Runx2、Osterix的蛋白水平

圖4 各組Rumx2及Osterix蛋白表達

3 討 論

對于骨科疾病的研究從古代時期便開始，從使用針灸、中醫手法復位，到中西醫結合治療等〔11〕，而對于一些類似于骨損傷，骨軟骨缺損，或者一些由惡性腫瘤細胞引起的異常骨樣來說〔12〕，還是需要利用好現代的生物力學及微觀發展思路〔13〕。BMSCs是一種多能干細胞，能夠分化為多種成熟細胞，例如成骨細胞、脂肪細胞等，除此之外，還具有分離、體外擴增、免疫等功能，并且在血管的生成及組織修復方面還具有極其重要的治療潛能〔14,15〕。

近年來有不少針對成骨細胞分化的研究，有研究表明miRNA作為一種關鍵的轉錄后調控RNA，在成骨細胞分化方面承擔著至關重要的調控角色〔16〕，并且已有多項研究發現，屬于miRNA超家族的部分成員在BMSCs向成骨細胞分化的這一進程中具有重要的作用，比如Zhang等〔17〕在了解到人脂肪來源的干細胞可以作為骨再生中的種子細胞來源后，提出如何改善骨組織工程中脂肪間充質干細胞(hASCs)成骨分化，及各種因子是如何調節這一分化的問題，他們通過實時PCR對miR-218的表達進行檢測，結果顯示在成骨分化的這個過程中miR-218出現了表達上調的情況，并且miR-218能夠直接靶向分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)2和Dickkopf相關蛋白(DKK)2，它的過表達可以提高Wnt/β-連環蛋白信號傳導的活性，使成骨細胞更快的分化；楊楠等〔18〕，針對骨質疏松患者特有的骨吸收能力加快、骨形成能力下降這一問題為導向，來探究骨形成能力與骨分化能力的關系，研究發現絕經后骨質疏松患者成骨能力會有所減弱，而通過miR-21對細胞轉染，降低軟脂酰化磷蛋白(Spry1)的表達可恢復成骨分化水平。miR-21最早在人腦瘤中發現，現今在發育、干細胞生物學等眾多領域均有所涉及，尤其在腫瘤的發展中應用較多〔19〕，對細胞的增殖凋亡能夠起到調控作用。TGF-β是一種具有多種功能的生長因子，能夠影響不同種類型的細胞，具有調控細胞生長分化、遷移、凋亡等效用〔20〕，其家族成員包括TGF-β、activin、骨形態發育蛋白(BMP)等，其各自介導的信號通路具有不同的作用〔21〕。

本文結果提示過表達miR-21可以使其靶基因TGF-β1、TGF-βR2的表達上調。過表達miR-21可能促進BMSCs分化為成骨細胞。

綜上所述，miR-21能夠促進BMSCs分化為成骨細胞，其機制可能是通過上調TGF-β/activin信號通路中TGF-β1、TGF-βR2的表達來促進其分化。