茶多酚對十二指腸潰瘍模型黏膜碳酸氫鹽轉運蛋白的作用

肖鵬 肖宏 金海

(1遵義市紅花崗區人民醫院消化內科，貴州 遵義 563000；遵義醫科大學 2第二附屬醫院消化內科；3附屬醫院消化病醫院 附屬醫院消化內科)

十二指腸潰瘍(DU)是臨床常見的消化系統疾病，與幽門螺桿菌(HP)感染、藥物損傷、精神心理因素、不良飲食習慣、自身免疫等因素密切相關〔1〕。其發生機制主要是由于十二指腸黏膜損傷因素和保護因素失衡引起。十二指腸黏膜碳酸氫鹽轉運蛋白分泌的碳酸氫鹽是抵抗胃酸、胃蛋白酶損害的主要防御機制〔2〕。因此增加十二指腸潰瘍患者的碳酸氫鹽轉運蛋白分泌有助于十二指腸潰瘍的愈合。茶多酚是一種天然的生物制劑，研究顯示，茶多酚在創面損傷、口腔潰瘍、潰瘍性結腸炎等疾病中具有一定作用〔3〕。本研究探討茶多酚對十二指腸黏膜碳酸氫鹽轉運蛋白的作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 人十二指腸黏膜組織均取自2020年1月至2020年6月就診于遵義市紅花崗人民醫院內鏡中心的患者。患者均簽署知情同意書。SD大鼠：40只8～12周齡SD大鼠，體重180～220 g，均購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010，飼養于貴州省消化疾病研究所動物室。

1.2主要藥物及試劑 茶多酚購于成都瑞芬思公司；半胱胺鹽酸鹽(C106201-100 g，阿拉丁公司)；Anti-離子交換體(SLC)26A3抗體(ab83545)，Anti-囊性纖維化跨膜傳導調節因子(CFTR)抗體(ab2784)購于Abcam公司；兔二抗(HS101-01)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(DQ111-01)、電化學發光(ECL)劑(DW101-01)、actin內參抗體(HC201-02)、逆轉錄試劑盒(AE311-03)、聚合酶鏈反應(PCR)擴增酶(AQ601-02)均購于全式金生物科技有限公司。

1.3動物造模及給藥 將40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組(茶多酚100 mg/kg)及高劑量組(茶多酚300 mg/kg)各10只。所有大鼠禁食不禁水24 h后，模型組及低、高劑量組于大鼠經頸背后皮下松弛處皮下注射10%鹽酸半胱胺(300 mg/kg)，對照組采用同樣操作，在頸背后注射同等劑量生理鹽水，自由飲食。造模24 h后，為了保持潰瘍的慢性過程，此后給模型組和低、高劑量組大鼠飲用1% 的半胱胺水來替代飲用水，對照組飲水正常；造模后48 h開始，連續以灌胃法給予低、高劑量組茶多酚，對照組和模型組給予同等劑量生理鹽水；觀察大鼠的精神活動、飲食飲水等情況，連續給藥4 w后處死大鼠，觀察大鼠十二指腸潰瘍的肉眼觀及蘇木素-伊紅(HE)染色情況，評判治療效果。收集大鼠十二指腸組織，用RT-PCR，Western印跡檢測組織中碳酸氫鹽轉運蛋白CFTR及SLC26A3的含量。

1.4十二指腸黏膜組織HE染色及SLC26A3和CFTR測定 HE染色：將固定好的十二指腸組織脫水、包埋、切片，80℃烤箱烤片20 min，過二甲苯2×15 min，自然水洗后，蘇木素染色1 min，過1%鹽酸乙醇進行分化，自來水沖洗返藍，伊紅染色1 min，過梯度酒精后，過二甲苯2×15 min，封片、晾干、觀察。Western印跡：提取蛋白，測定濃度后，加入上樣緩沖液進行煮沸后上樣，進行電泳、電轉；轉膜后采用含5%脫脂牛奶TBST進行封閉，室溫封閉2 h；加入1抗4℃過夜，用TBST清洗3次×10 min；加入2抗，室溫孵育1 h，用TBST清洗3次×10 min；加入ECL液后進行曝光，采用Graphpad軟件進行分析。免疫組化染色：將固定好的十二指腸組織脫水、包埋、切片，80℃烤箱烤片20 min，過二甲苯2×15 min，過梯度酒精進行水化，采用枸櫞酸鹽進行抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次×5 min，采用3%H2O2封閉內源性過氧化氫酶，PBS清洗3次×5 min，封閉內源性抗原，滴加一抗過夜，PBS清洗3次×5 min，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素染核，過梯度酒精，封片。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1十二指腸潰瘍患者CFTR、SLC26A3表達 正常組織十二指腸黏膜上皮黏膜完整，無水腫，僅少量炎癥細胞浸潤，而潰瘍組十二指腸黏膜上皮連續性破壞，有大量炎癥細胞浸潤，腺體水腫。免疫組化顯示，正常黏膜上皮均表達CFTR和SLC26A3，而十二指腸潰瘍組織十二指腸黏膜上皮表達量明顯下降。見圖1。與正常組織比較，十二指腸潰瘍組織CFTR、SLC26A3蛋白和mRNA表達水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。圖2、表1。

圖1 人十二指腸黏膜上皮HE染色及CFTR、SLC26A3免疫組化染色(×200)

圖2 正常組織和十二指腸潰瘍組織CFTR和SLC26A3蛋白表達

2.2茶多酚對大鼠體重及進食情況的影響 在造模前各組體重及進食量之間無顯著差異(P>0.05)。造模后，大鼠體重增長較對照組明顯慢，進食量較對照組明顯減少(P<0.05)。給予茶多酚灌胃后，高劑量組體重及進食量與模型組差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR、SLC26A3免疫組化 與對照組相比，模型組十二指腸黏膜上皮CFTR和SLC26A3表達減少，服藥后，低劑量組和高劑量組CFTR和SLC26A3表達均增加，高劑量組表達增加明顯。見圖3。

2.4茶多酚治療UC大鼠十二指腸黏膜的形態學觀察 對照組十二指腸黏膜形態完整，黏膜上皮細胞排列緊密，炎癥細胞浸潤少見。模型組十二指腸絨毛損傷嚴重，固有層分布疏散，黏膜上皮大面積脫落，中央乳糜管消失，固有層及黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤。給予茶多酚治療后，黏膜較模型組大鼠黏膜好轉，固有層排列尚整齊，上皮損傷和脫落減少，炎癥細胞浸潤減少。見圖3。

2.5茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA 表達 與對照組相比，模型組十二指腸黏膜上皮CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA表達減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。服藥后，低劑量組和高劑量組CFTR和SLC26A3表達均增加，高劑量組CFTR和SLC26A3的蛋白和mRNA表達增加明顯，較模型組差異顯著(P<0.05)。見圖4、表3。

表1 正常組織和十二指腸潰瘍組織CFTR、SLC26A3蛋白和mRNA表達

表2 茶多酚對十二指腸潰瘍大鼠體重變化及進食量的影響

圖3 茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜HE染色和CFTR、SLC26A3免疫組化染色(×200)

圖4 茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR和SLC26A3蛋白表達

表3 茶多酚治療DU大鼠十二指腸黏膜CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA 表達

3 討 論

目前中醫藥及生物制劑在消化性潰瘍的臨床研究及實驗研究中顯示了良好的療效〔4〕。這些制劑在消化性潰瘍的治療作用主要通過減弱損傷性因子和加強防御性因子實現的〔5〕。其療效及作用機制在胃潰瘍中的研究較多，而對十二指腸潰瘍治療療效及其作用機制尚缺乏。

研究發現，十二指腸潰瘍的發生除了與胃酸和胃蛋白酶的侵襲作用加強，也與十二指腸黏膜碳酸氫鹽的分泌減少〔6〕。碳酸氫鹽分泌的除了受神經體液、激素、胃酸、膽汁等的影響外，還受到碳酸氫鹽轉運蛋白的調控。十二指腸碳酸氫鹽轉運蛋白主要包括CFTR和Cl-/HCO3-SLC26家族〔7，8〕。SLC26A6在胃腸道碳酸氫鹽的分泌中起著重要作用。CFTR和SLC26家族在多種器官如：肝臟、胰腺、腎臟、胃腸道、心臟、肺臟等有豐度的表達，在pH值穩態維持、免疫、腫瘤的發生、生物的發育中等起著重要作用〔9〕。CTTR和SLC26受多種信號通路的調控〔10，11〕。近年來，茶多酚這一天然生物制劑在抗氧化、抗感染、抗衰老、抗菌、抗癌變及在心肌保護、潰瘍性結腸炎治療、難治性口腔潰瘍治療和心血管疾病預防中起到重要作用〔12〕。而茶多酚通過多種作用機制實現其保護作用，如通過降低或者減少氧自由基的產生、調控磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)信號通路、核因子(NF)-κB信號通路及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路等〔13，14〕。可推測茶多酚能夠通過調控十二指腸碳酸氫鹽轉運蛋白的表達，提高碳酸氫鹽的分泌，促進十二指腸潰瘍的愈合。本研究結果提示，茶多酚對十二指腸潰瘍的保護作用可能通過促進碳酸氫鹽轉運蛋白提高碳酸氫鹽的分泌量實現的。

綜上，十二指腸潰瘍的誘因復雜，包括HP感染、非甾體類抗炎藥物、自身免疫因素、飲食、生活規律差、社會心理因素等。十二指腸潰瘍主要臨床表現是腹痛和消化不良，嚴重時會引起消化道出血及穿孔。質子泵抑制劑(PPI)能夠有效治療十二指腸潰瘍，但對于難治性潰瘍，藥物服用依存性差、PPI制劑不良反應較多的患者，可以考慮采用茶多酚這一安全有效的生物制劑。