miR-613 抑制膠質瘤增殖及侵襲能力

賀彬 丁晨哲 劉家陽

(1固原市人民醫院神經外科，寧夏 固原 756000；2寧夏回族自治區人民醫院神經外科)

惡性膠質瘤是中樞神經系統最常見、最具侵襲性的原發腫瘤，約占中樞神經系統腫瘤的30%，腦惡性腫瘤的80%〔1〕。盡管采取了積極的療法，包括外科手術切除，放療和化學療法，但膠質瘤患者的預后仍然很差，主要是由于其明顯的惡性增殖和浸潤。微小RNA(miRNA)是一類小型非編碼RNA，通過靶向3′-非翻譯區(3′-UTR)調控信息RNA (mRNA)，從而抑制基因表達。由于miRNAs介導靶基因的表達，它們參與了多種生物過程的調控，如細胞增殖、侵襲、凋亡和分化〔2〕。miRNA在膠質瘤起始和進展的調控中也起著關鍵作用〔3,4〕，miR-613是一種新型的與癌癥相關的miRNA，已被證明可抑制包括肝癌〔5〕、宮頸癌〔6〕、大腸癌〔7〕等多種癌癥中的腫瘤發生和發展〔8〕。雖然miR-613已被證明可以抑制多種惡性腫瘤細胞增殖和集落形成〔9,10〕，但miR-613在膠質瘤中的功能和潛在機制仍不清楚。本研究旨在探討miR-613對神經膠質瘤的增殖及侵襲能力的影響和調控機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養和細胞轉染 U87MG人腦膠質瘤細胞為星形膠質細胞瘤，分級為Ⅳ級(購自中國科學院上海研究所)。細胞在含有10%胎牛血清和5% CO2的RPMI1640培養基(GIBCO，USA)中培養。培養基保持在濕度為95%的CO2培養箱中，溫度為37℃。為了進行實驗，根據制造商的方案，使用miR-613模擬物(HaiJima生物技術公司)、miR-613抑制劑(HaiJima生物技術公司)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和miR-613模擬物+G6PD(Lipofectamine 2000，Invitrogen，美國)轉染U87MG細胞，分別記為miR-613模擬物組、miR-613抑制劑組、G6PD組、miR-613+G6PD組。培養24～48 h后，收集細胞，用TRIzol提取總核糖核酸。轉染72 h后，用Western印跡法測定細胞的蛋白質表達。

1.2樣本收集 2015年2月至2018年9月，寧夏回族自治區人民醫院神經外科共確診48例膠質瘤患者，其中男26例，女22例，平均年齡(48.5±12.4)歲。納入的患者未患其他疾病，也未接受放療、化療和激素療法。根據世界衛生組織(世衛組織)制定的神經系統腫瘤分類〔11〕，神經膠質瘤組織被兩名獨立病理學家分類為：Ⅰ級(6例；毛細胞型星形細胞瘤)，Ⅱ級(18例；彌漫性星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、原生質性星形細胞瘤、中樞神經系統細胞瘤、室管膜瘤)，Ⅲ級(14例；間變性星形細胞瘤、間變性細胞瘤、間變性室管膜瘤)和Ⅳ級(10例；膠質神經母細胞瘤，髓母細胞瘤)。Ⅰ級和Ⅱ級為低級別膠質瘤組織，Ⅲ級和Ⅳ級為高級別膠質瘤組織。除此之外，從進行尸檢的患者中收集20個正常腦組織樣本作為對照，并將所有樣本置于液氮中。整個程序得到了醫院倫理委員會的批準，所有患者簽署了知情同意書。

1.3RNA提取和RT-PCR 用TRIzol試劑(Invitrogen,CA,USA)提取細胞或人體組織中核糖核酸。使用紫外分光光度計在260和280 nm處測量吸光度，并且在260和280 nm的吸光度比率用于評估核糖核酸的純度。使用逆轉錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)合成cDNA，以量化miR-613和G6PD。通過實時熒光定量分析，用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo,Japan),擴增cDNAs，并使用β-肌動蛋白(β-actin)作為內源性對照。聚合酶鏈反應條件:95℃變性10 s，60℃退火20 s，在72℃延伸34 s。上述步驟循環40次進行擴增。

1.4Western印跡法檢測相關蛋白水平 使用RIPA緩沖液裂解總細胞提取物。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。一抗包括抗G6PD、抗細胞外調節蛋白激酶(ERK)、抗磷酸化(p)ERK、抗c-Fos和抗β-actin(Santa Cruz Biotechnology,USA)。用Tris-緩沖鹽水和TBST洗滌膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶結合的二級抗體，并在室溫下孵育1 h。之后，用TBST洗滌膜3次，每次10 min，通過增強化學發光顯影并拍照。

1.5CCK-8細胞增殖檢測 細胞轉染24 h后，U87MG細胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基培養成單細胞懸液，然后置于每孔含1×104個細胞的24孔板中，在5% CO2培養箱中孵育。使用細胞計數試劑盒-8 (CCK-8,Japan)在24、48、72和96 h測量細胞增殖。此外，將10 μl CCK-8溶液加入100 μl培養基中，細胞在37℃孵育4 h后，檢測每個孔在450 nm波長下的光密度。繪制細胞生長曲線，其中橫軸代表不同的測量時間，縱軸代表吸收值。

1.6Transwell細胞體外侵襲實驗 轉染24 h后收集細胞，用濃度為5×105細胞/ml的無血清培養基懸浮。神經膠質瘤細胞的體外侵襲性通過涂有基質凝膠(BD,Biosciences)的8 μm孔的Transwell小室(Corning Incorporated Life Sciences)進行評估。此外，將200 ml細胞懸液加入上腔室，并將10% FBS培養基置于匹配的下腔室中，在37℃下培養24 h。用棉簽擦拭上腔室中的非侵入細胞，用多聚甲醛(PFA)固定遷移到下膜中的細胞20 min，并用0.1%結晶紫(Beyotime)染色。使用顯微鏡(Olympus)在每個孔的6個隨機選擇的區域觀察和計數染色的細胞。實驗被獨立重復3次。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1膠質瘤腦組織和正常腦組織中miR-613和G6PD水平比較 與正常腦相比，膠質瘤組織中miR-613的表達顯著下調(P<0.05)。與低級別膠質瘤組織比較，miR-613表達在高級別膠質瘤組織顯著下調(P<0.05)，G6PD基因在膠質瘤組織中高表達，并隨惡性程度增加而增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2miR-613直接抑制膠質瘤中G6PD的表達 與空白對照組和miR-613 NC組比較，miR-613模擬物組，G6PD表達水平顯著降低，miR-613顯著升高(P<0.05)；miR-613抑制劑組G6PD表達水平上調，miR-613顯著下調(P<0.05)。見表2和圖1。

表1 不同組織中miR-613和G6PD mRNA表達水平比較

表2 各組miR-613和G6PD mRNA表達比較

1～4：空白對照組，miR-613 NC組，miR-613模擬物組，miR-613抑制劑組圖1 miR-613直接抑制G6PD在膠質瘤中表達

2.3miR-613通過靶向G6PD抑制ERK途徑 與空白對照組相比，miR-613組pERK、c-Fos和G6PD蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。與miR-613組相比，miR-613+G6PD組和G6PD組的pERK、c-Fos和G6PD蛋白水平顯著增加(P<0.05)。與miR-613+G6PD組相比，G6PD組的pERK、c-Fos和G6PD蛋白水平顯著增加(P<0.05)。見圖2、 表3。

1～5:空白對照組，miR-613 NC組，miR-613組，miR-613+G6PD組，G6PD組圖2 Western印跡法檢測各組相關蛋白表達水平

表3 各組細胞中蛋白相對表達水平

2.4miR-613靶向G6PD抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲 與空白對照組相比，miR-613組48、72、96 h OD450值及侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)；與miR-613組相比，G6PD組和miR-613+G6PD組48、72、96 h 的OD450值及侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05)；與miR-613+G6PD組相比，G6PD組48、72、96 h 的OD450值及侵襲細胞數顯著升高(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 細胞中各個時間點不同組別膠質瘤細胞的OD450 nm相對值及侵襲細胞數比較

圖3 miR-613通過靶向G6PD抑制膠質瘤細胞侵襲(結晶紫染色，×200)

3 討 論

膠質瘤是一種預后差的原發性惡性腦腫瘤，最常見的亞型(膠質母細胞瘤)的中位生存時間只有14個月〔12〕。膠質母細胞瘤起始細胞能抑制T細胞的增殖，增強免疫抑制調節性T細胞的凋亡〔13〕。miRNA的失調已成為惡性神經膠質瘤的主要特征，一些miRNA可能是膠質瘤診斷和預后的潛在新生物標記〔14,15〕。部分miRNAs已被證明參與抑制膠質瘤的進展和發展，是膠質瘤的潛在治療靶點〔15〕。既往研究表明miR-613在多種類型的癌癥中下調，并作為腫瘤抑制因子發揮作用〔5,6,8,10,16～18〕。如miR-613通過靶向formin樣蛋白2抑制結腸直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并在G1期誘導細胞周期停滯〔18〕。miR-613在骨肉瘤細胞中過表達，通過調控細胞周期阻滯在G0/G1期，顯著抑制腫瘤細胞的增殖和集落形成，損害細胞的遷移和侵襲能力，進而通過抑制c-MET抑制上皮-間充質轉化〔19〕。miR-613在體外顯著抑制甲狀腺癌細胞的生長、遷移和侵襲，在體內通過靶向鞘氨醇激酶2抑制腫瘤生長〔20〕。本研究中，miR-613在膠質瘤組織中的表達顯著降低，在高級別膠質瘤組織中的表達顯著降低。miR-613的異常表達可能與人腦膠質瘤的發生有關。此外，本研究還發現G6PD蛋白在膠質瘤組織中的表達水平高于正常腦組織。G6PD是miR-613的直接靶標〔8〕，而G6PD過表達被證明在食管癌中逆轉了miR-613的作用〔16〕。在多種類型的惡性腫瘤中均存在G6PD活性的異常上升〔21～24〕。G6PD的主要作用是通過戊糖磷酸途徑產生核糖和還原性等效的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。G6PD是維持細胞生長和發育的典型管家酶。G6PD活性減弱或功能失調會阻礙正常細胞增殖及胚胎和器官發育〔25,26〕。快速生長的癌細胞已經進化出多種機制來激活G6PD，以支持NADPH生成和脂肪酸及核酸合成的細胞需求〔27,28〕。本研究結果顯示膠質瘤腦組織中的miR-613表達水平下降，而G6PD的水平上升,并且MiR-613直接抑制膠質瘤中G6PD的表達。

ERK通路在膠質瘤細胞的生長和增殖中起著至關重要的作用。ERK信號通路可影響包括轉錄因子和其他與細胞周期進程、分化和蛋白質翻譯相關的激酶的磷酸化。參與ERK信號轉導的分子的異常表達被認為在癌癥的發展過程中發揮重要作用〔29〕。例如，Alves等〔30〕利用結腸模型證明，上調ERK信號通路可使G6PD誘導自噬，從而促進結直腸癌的生存。并且ERK信號可以被一些結合上游分子或下游受體的因素所抑制。本研究結果提示G6PD可能是miR-613的直接靶點，參與了miR-613抑制增殖和侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-613在膠質瘤中下調，而miR-613過表達與膠質瘤細胞ERK信號通路降低相關，從而抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲。本研究為膠質瘤的發病機制提供了新的認識，為膠質瘤的治療提供了一個潛在的有效靶點。