亞麻醉濃度的七氟烷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響

徐達 許旭東 潘春英 酈惠芳 商建飛 張愛萍

(常州市中醫醫院麻醉科，江蘇 常州 213000)

腦卒中的致殘率、發病率、死亡率及復發率隨著人口老齡化的進展而逐年升高，該病以患者出現局灶性神經功能障礙或缺失為主要臨床表現，給患者的家庭帶來沉重的經濟和精神負擔，不利于社會公共健康衛生事業的可持續發展。溶解血栓、恢復腦內血流是目前常用的干預措施，但是在溶栓再灌注干預過程，不可避免地出現腦缺血再灌注損傷(CIRI)〔1〕。既往的研究〔2〕多從改善患者的神經功能、減輕患者腦組織的炎性應激阻滯有害物質進入腦實質的等方面入手，并未取得突破性的進展，形成完善的治療手段使患者從中受益免于疾病困擾。血腦屏障(BBB)是機體腦組織與腦部微血管的分界面，是維持顱內環境穩定的重要的結構基礎。在腦缺血發生后BBB的通透性直接影響缺血對腦損傷的程度。Hassonizadeh等〔3〕研究顯示在CIRI大鼠模型中，改善BBB的通透性可降低實驗動物的腦梗死的面積。但并未詳細地闡明其中的分子機制。七氟烷是一種臨床上常用的吸入麻醉藥，其誘導麻醉速度快，麻醉深入便于控制，恢復蘇醒時間段，廣泛用于心腦血管外科手術中的麻醉。Ou等〔4〕研究顯示，亞麻醉濃度的揮發性的麻醉劑(如七氟烷等)能調控急性腦梗死小鼠的神經元細胞的靜息膜電位，調控神經元細胞的生長與興奮性。但是有關亞麻醉濃度的七氟烷對腦缺血再灌注損傷的作用機制報道較少。本研究通過構建局灶性CIRI大鼠模型，從BBB的角度入手，探討亞麻醉濃度的七氟烷對腦組織的保護機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器 SPF級雄性SD大鼠，9～12周齡，250～280 g，40只，由杭州拓實生物科技有限公司提供，動物的許可證號SYXK(浙)2020-0025，所有實驗動物在常州市中醫醫院SPF及動物房中適應性飼養1 w后用于實驗，飼養設定條件：溫度22℃～25℃，濕度(45±15)%，自然光照，常規基礎飼料，自由飲水。本研究經醫院動物倫理委員會的批準，并在實驗過程中盡最大努力減少動物的傷亡及痛苦。七氟烷購自魯南貝特制藥有限公司；尼莫地平(20 mg×50片，廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字：H44025019)。戊巴比妥鈉、多聚甲醛、組織裂解液、化學增強顯色劑(南京建成生物科技有限公司)，蛋白濃度檢測試劑、Western印跡試劑盒、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色試劑盒、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)染色試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，兔抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司。X71光學顯微鏡(日本Olympus公司)，Universal Hood Ⅱ凝膠成像處理系統(美國Bio-rad公司)，Philips 201透射電子顯微鏡(荷蘭Eindhoven公司)，超薄切片機(德國Leica公司)。

1.2模型構建和分組 術前將大鼠禁食不禁水12 h后，參照Abdel-Rahman等〔5〕介紹的方法進行造模構建局灶性CIRI大鼠模型：腹腔注射戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，待動物失去意識后固定在無菌實驗臺上，消毒備皮，頸部正中切開，顯微鏡下鈍性分離頸總動脈、頸內外動脈，穿線，在距頸外動脈近動脈分叉約1 cm結扎頸外動脈，結扎線插入的深度在18 cm上下，當栓線呈現一定的波動感，以示頸內動脈沒有完全阻塞，表示結扎成功，在動物缺血2 h后松開線栓進行再灌注，假手術組的動物只進行穿線，不進行結扎和再灌注。術后2 h，進行神經功能評價：無神經功能缺失癥狀，能夠正?；顒訛?分；大鼠出現左側前爪不能完全伸展的情況為1分；大鼠爬行時出現轉圈走的現象為2分；大鼠行走時身體向一側傾倒的現象為3分；大鼠出現意識喪失，不能自主行走的現象為4分，其中獲得1～3分的大鼠表示造模成功。

將造模成功的30只大鼠按照隨機數字表法依次分為模型組、實驗組和對照組，每組10只，另取10只大鼠為假手術組，假手術組在造模術中只進行穿線，不結扎；其中實驗組每日給以1.2%七氟烷吸入治療3 h，對照組每日給以1.08 mg/ml的尼莫地平灌胃給藥，模型組和假手術組以等劑量的生理鹽水進行灌胃處理，所有大鼠以單籠、基礎飼料喂養。

1.3各組神經功能評價 連續處理1 w后，再次對動物進行神經功能評價，留取2 ml尾靜脈血，離心后，留取上清待測；然后將大鼠斷頭處死，取出各組大鼠的腦組織，注意保持動物腦組織的完整性。

1.4各組腦梗死面積比較 取腦組織標本，制成厚度約為2 μm的冠狀切片，TTC工作液避光染色，正常腦組織中因含與TTC發生特異性反應的酶而呈紅色，缺血區域因酶活下降不能與TTC發生特異性的結合而呈現蒼白色〔6〕，圖像分析測量系統統計分析大鼠腦組織的腦梗死面積比例大小。

1.5各組腦組織病理損傷變化 取腦組織標本，中性甲醛溶液固定，脫水，包埋，制成厚度在3～5 μm的冠狀石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.6各組腦組織的超微結構損傷病理 取腦組織標本，在戊二醛溶液(濃度約為3%)中固定1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，1%四氧化鋨固定90 min，無水乙醇梯度脫水，中性樹脂包埋，切片，依次經洗滌、脫水、切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，Philips 201透射電子顯微鏡鏡下觀察，拍照。

1.7各組腦組織細胞凋亡 取腦組織，按TUNEL染色試劑盒要求進行預處理，抗原修復，封閉，標記，避光染色，脫水，中性樹膠封片，鏡檢，視野中被染成黃褐色的細胞為凋亡細胞〔7〕，細胞的凋亡率等于TUNEL陽性細胞數與總細胞的比值。

1.8各組大鼠BBB的通透性比較 處死大鼠24 h前，股靜脈注射4%伊文思藍(EB)染料5 ml/kg，按EB染色試劑盒要求進行生理鹽水及固定液灌注，處死大鼠后，取各組大鼠的腦組織，常規固定48 h，梯度濃度蔗糖溶液脫水，制成約8 μm的切片，顯微鏡下觀察。

1.9各組血清指標檢測 按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒要求，檢測各組大鼠血清中白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性相關因子含量的變化。

1.10各組腦組織中閉合蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白(Claudin)-5、閉鎖連接蛋白(ZO)-1等細胞連接蛋白的表達 取各組腦組織，在4℃裂解液中放置30 min，離心，并將上清液稀釋，常規方法提取樣本中的總蛋白，以50 μg樣品進行上樣，電泳后，轉模，封閉，加入一抗(1∶1 000)，二抗(1∶5 000)稀釋后，室溫孵育后，顯色30 min，以GAPDH為參照，分析目標蛋白的灰度值。

1.11統計學分析 采用Graphpad8.0進行作圖，采用SPSS16.0軟件進行單因素分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組一般狀態及神經功能評分比較 假手術組反應敏捷，活潑好動，皮毛光亮，飲食與進水未見明顯異常，體重增加較為明顯；模型組皮毛雜亂，暗淡無光，活動量明顯減少，反應遲鈍，大鼠經常以鼠尾為中心轉圈，四肢協調性不高，弓背明顯，食欲不良，體重增加不明顯；與模型組相比，實驗組及對照組癥狀明顯改善，大鼠四肢協調趨于正常，飲水與進食量明顯增加，體重較模型組增加較為明顯。神經功能評價結果顯示，與假手術組相比，模型組、實驗組、對照組神經功能評分明顯升高(均P<0.05)，與模型組相比，實驗組、對照組神經功能評分明顯下降(均P<0.05)，對照組和實驗組神經功能差異不明顯(P>0.05)，見表1。

2.2各組腦梗死面積比較 TTC染色結果顯示，與假手術組相比，模型組、實驗組、對照組腦組織的梗死面積明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實驗組、對照組腦組織的梗死面積明顯下降(均P<0.05)，對照組和實驗組腦組織的梗死面積差異不明顯(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組神經功能評分、腦梗死面積、腦組織細胞凋亡率比較

圖1 各組腦組織(TTC染色，×10)

2.3各組腦組織病理損傷變化 HE染色結果顯示，假手術組腦組織的神經元細胞結構完整，排列緊密，大小均勻，胞質中內容物豐富，核膜、核仁及尼式體均清晰可辨，神經纖維未見明顯異常，毛細血管無水腫現象出現；模型組腦組織中可見明顯的壞死灶點，壞死灶點周圍較多的壞死的神經元細胞，炎性細胞浸潤，神經元細胞排列松散，或大或小，胞核固縮嚴重，胞體損傷明顯，空泡樣變性明顯，核質界限不明，神經纖維或斷裂或缺失，腦部血管結構不完整。與模型組相比，實驗組及對照組腦組織的神經損傷明顯改善，細胞內空泡樣變性趨于緩解，核質界限趨于清晰，腦梗死周圍的神經元細胞損傷趨于恢復，見圖2。

2.4各組腦組織超微結構損傷病理變化 電鏡下觀察結果顯示，假手術組神經元細胞結構清晰完整，核仁大且圓，染色質未見明顯異常，核糖體、內質網、線粒體等細胞器性狀穩定；模型組腦組織神經元細胞超微結構損傷明顯，核膜凹陷或溶解明顯，核仁消失，胞質中的細胞器數量明顯減少，線粒體損傷嚴重，雙層膜結構不清晰，腫脹明顯，內質網斷裂，核糖體脫顆粒現象明顯；與模型組相比，實驗組及對照組腦組織神經元超微結構損傷明顯緩解，線粒體的雙層膜結構逐漸清晰，核膜溶解現象明顯減輕，染色質的固縮聚集狀態明顯減少，見圖3。

圖2 各組腦組織(HE染色，×400)

圖3 各組腦組織超微結構(×10 000)

2.5各組腦組織細胞凋亡 TUNEL染色結果顯示，與假手術組相比，模型組、實驗組、對照組腦組織細胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實驗組、對照組腦組織的細胞凋亡率明顯下降(均P<0.05)，對照組和實驗組腦組織的細胞凋亡率差異不明顯(P>0.05)，見表1、圖4。

圖4 各組腦組織細胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.6各組BBB通透性比較 EB染色結果顯示，與假手術組相比，模型組、實驗組、對照組腦組織EB的滲出量明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實驗組、對照組腦組織EB的滲出量明顯下降(均P<0.05)，對照組和實驗組腦組織EB的滲出量差異不明顯(P>0.05)，見圖5，表2。

2.7各組血清指標比較 酶聯免疫吸附實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組、實驗組、對照組血清中IL-1β和TNF-α含量明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實驗組、對照組血清中IL-1β和TNF-α含量明顯下降(均P<0.05)，對照組和實驗組血清中IL-1β和TNF-α含量差異不明顯(P>0.05)，見表2。

2.8各組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白表達 Western印跡結果顯示，與假手術組相比，模型組、實驗組、對照組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相對表達明顯降低(均P<0.05)；與模型組相比，實驗組、對照組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相對表達明顯升高(均P<0.05)，實驗組和對照組相比差異無統計意義(P>0.05)，見圖6，表3。

圖5 各組BBB通透性(EB染色，×400)

表2 各組腦組織EB的滲出量、血清中IL-1β、TNFα含量比較

圖6 各組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白的表達

表3 各組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相對表達

3 討 論

缺血性腦卒中又被稱為腦梗死，是由多種原因引起的腦組織局部區域出現血液供應障礙，腦神經元細胞在缺血、缺氧情況下異常凋亡，腦組織出現不可逆的損傷，進而誘發神經功能障礙及運動功能障礙，肢體自主能力受限，影響患者的正常生活。CIRI是在腦組織恢復血流致使腦組織損傷進一步加重的現象。其病理機制尚處于實驗研究階段，臨床上尚缺乏根治性的治療措施。大量的研究顯示〔8〕，CIRI的病理機制涉及能量代謝障礙、炎癥性與氧化應激、酸中毒等多個生理病理過程。但有研究顯示〔9〕，BBB的通透性增加與CIRI的關系密切。當CIRI的發生導致患者的BBB的開放，血液及血漿中的組分由此進入腦實質誘發患者出現血管性的腦水腫，致使腦組織神經元的損傷進一步加劇。因此研究BBB通透性的改變成為干預CIRI的一個新思路，改善腦梗患者的BBB，有助于降低患者的神經障礙程度，提高患者的日常生存質量。

七氟烷是使用較為廣泛的麻醉藥。但最新的研究顯示七氟烷不僅具有良好的鎮靜催眠的效用，并且在外科手術中具有對肝、肺、心、腦等器官保護的作用。Tuncay等〔10〕研究顯示，在下肢缺血再灌注損傷大鼠模型中，七氟烷能明顯抑制肺組織中的氧化應激的酶活性，發揮對非保護的作用。Shiraishi 等〔11〕研究顯示，在肝移植和肝切除等因素導致的大鼠肝缺血再灌注損傷模型中，七氟烷的應用能明顯抑制肝細胞的異常凋亡。Xie 等〔12〕研究報道，在糖尿病心肌缺血再灌注小鼠模型中，七氟烷(1.2%)能明顯抑制炎性相關信號的傳導，抑制心肌炎性反應的級聯放大。Yue等〔13〕研究顯示，吸入性麻醉劑七氟烷(1.2%)能激活神經系統的自我防御機制，增強神經元對CIRI的耐受作用。本研究中七氟烷的濃度為1.2%，屬于亞麻醉范圍濃度，本研究結果證實了治療手段對疾病的干預作用。

BBB是將腦組織和血液進行分隔的一個復雜的細胞系統，其主要功能是調控某些物質在血液循環和中樞神經區域的交換，進而保護中樞神經元細胞內環境的穩定，其通透性的改變與中樞神經元細胞的損傷、變性、炎性應激及凋亡、壞死等生理過程關系密切〔14〕。Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白是構成BBB的結構基礎。Liu等〔15〕研究顯示，CIRI發生后，BBB的結構被破壞，其正常功能隨之發生嚴重的障礙。Khamchai等〔16〕研究顯示，在CIRI后，改善大鼠腦組織BBB的通透性，有助于炎性因子進入中樞神經區域的量，保護腦組織免于過于激烈的炎性損傷。本研究結果證實藥物對BBB的修復作用。

綜上，亞麻醉濃度的七氟烷能明顯改善局灶性CIRI大鼠BBB的通透性，降低神經元的凋亡率，改善其神經功能。但是在臨床應用中，該干預手段能否發揮等效的作用，仍需要結合患者的個體特殊性及疾病的進展進行綜合考量。