宣白承氣湯對急性呼吸窘迫綜合征大鼠BTLA/HVEM通路及肺功能的影響

張軼強 李詠紅 向丹 張玉沛

(荊門市中醫醫院肺病科，湖北 荊門 448002)

2019年新型冠狀病毒疾病已在中國和世界各地發生，感染的重癥肺炎患者會迅速發展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，并因多器官衰竭而死亡。盡管支持治療方法有所進步，ARDS仍與高死亡率和高發病率有關〔1,2〕。ARDS是一種復雜的臨床綜合征，各種創傷、藥物攝入、細菌性或病毒性肺炎、敗血癥等引起的急性肺損傷(ALI)均可導致ARDS的發生〔3〕，其特征在于急性炎癥、呼吸急促、低氧血癥、彌漫性肺泡浸潤及肺血管和上皮通透性增加〔4〕。研究發現ARDS的發病與高炎癥免疫反應有關〔5〕，涉及先天性和適應性免疫系統的多種免疫細胞，如肺泡巨噬細胞和T細胞，這些免疫細胞介導肺損傷的發生發展〔6,7〕。近年來中醫藥在治療ALI/ARDS中取得顯著療效，宣白承氣湯就是其中一種，而且其在臨床上的使用頻次最多〔8〕。研究發現宣白承氣湯在新型冠狀病毒肺炎的治療上效果顯著〔9〕，可降低ARDS的病死率〔10〕。但具體作用機制尚不明確。宣白承氣湯對ALI/ARDS的治療是否與機體免疫系統有關尚未可知。本研究旨在探討其對ARDS肺損傷的影響及可能的作用機制，為ARDS治療和宣白承氣湯臨床更廣泛應用提供參考。

1 材料與方法

1.1動物 從北京維通利華動物中心購入SPF級Wistar大鼠72只，雄性，體質量(200±20)g，許可證號為SCXK(京)2016-0011，大鼠飼養在可控的環境中保持12 h明/暗循環，自由獲取食物和水。

1.2藥品及試劑 宣白承氣湯〔生石膏15 g，大黃(后下)10 g，苦杏仁15 g，瓜蔞皮15 g〕，以上藥材均購自河南張仲景大藥房；上述藥材加入8倍量的水分充分浸泡30 min，煎煮40 min，過濾藥液，藥渣再加入6倍量的水繼續煎煮40 min后過濾藥液，合并藥液并濃縮至1 ml相當于生藥2.5 g。

脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-10酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：RA20035、RA20020-S、RA20132、RA20090；異硫氰酸熒光素(FITC)標記小鼠抗大鼠CD3單抗(554832)、別藻藍蛋白(APC)小鼠抗大鼠CD4(550057)、藻紅蛋白(PE)標記小鼠抗大鼠CD8a單抗(554857)均購自美國BD Biosciences公司；FITC標記抗大鼠BTLA單抗、FITC標記抗大鼠HVEM單抗購自上海微蒙生物技術有限公司；血氣分析儀(型號：ABL90 FLEX，丹麥Radiometer)；多功能酶標儀、流式細胞儀(型號：iMark680、BD FACSCanto Ⅱ，美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(型號：IX73，日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備、分組及給藥 大鼠適應性飼養7 d后開始實驗，隨機選取12只大鼠為空白組，大鼠用3%戊巴比妥鈉以50 mg/kg的劑量腹腔內注射麻醉，除空白組外，其余大鼠參考文獻〔11〕通過氣管內滴入100 μl的LPS溶液(生理鹽水稀釋至5 mg/kg)造模；空白組氣管內滴入等量生理鹽水。24 h后，若大鼠出現精神萎靡，倦怠，活動減少，食欲減退，便秘等癥狀，呼吸頻數增加，出現呼吸窘迫，氧合指數<300 mmHg〔12〕，說明ARDS構建成功。將造模成功的60只大鼠隨機分為模型組、宣白承氣湯高、中、低劑量組(22.8、11.4、5.7 g/kg)，每組12只。開始給藥，宣白承氣湯各劑量組灌胃相應劑量的藥物，空白組和模型組灌胃等量生理鹽水，1次/d，給藥7 d。計量換算：給藥劑量按成人平均體質量60 kg體表面積換算，對應給藥劑量為成人的6.25倍，宣白承氣湯成人每日給藥劑量相當于生藥55 g，則大鼠每日給藥劑量為5.7 g/kg，因此設置低、中、高劑量藥物劑量為5.7、11.4、22.8 g/kg。

1.3.2形態學觀察 給藥期間，觀察各組大鼠的精神狀況、毛色、飲食、活動等一般狀態，并記錄。

1.3.3動脈血氣分析 大鼠稱重后，麻醉并記錄體重，從頸動脈抽取大鼠動脈血，立即使用血氣分析儀測定動脈血中的氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)；計算氧合指數(P/F)和肺泡-動脈血氧分壓差P(A-a)O2。本實驗大鼠吸入空氣(氧氣濃度21%)，故吸入氧氣濃度(FiO2)為0.21。

肺泡-動脈血氧分壓差〔P(A-a)O2，mmHg〕=(PIO2-PaCO2×1/R)-PaO2〔PAO2為肺泡氣氧分壓；PIO2為吸入氣氧分壓=FiO2×(大氣壓-47)；R為呼吸商，等于0.8〕。

1.3.4流式細胞術檢測大鼠外周血T淋巴細胞亞群 大鼠抽取動脈血后，用毛細管從眼眶取外周血樣品置于15 ml離心管(含1 ml抗凝劑)中，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進行離心，分離并棄去上清液。加入3 ml溶血素后，冰上放置4～5 min，離心，棄上清液，然后加入PBS，獲得外周血細胞懸液。將100 μl的外周血細胞懸液放入2 ml離心管中，然后與FITC標記抗大鼠CD3單抗、APC標記抗大鼠CD4單抗和PE標記抗大鼠CD8a單抗混合。在離心管中加入PBS，4℃的冰箱中避光孵育30 min。然后，添加1 ml PBS，300 r/min離心5 min。除去上清液后，加入0.5 ml PBS重懸并用流式細胞儀分析。

1.3.5肺濕/干比(W/D)評估 處死大鼠后，取出肺組織，將大鼠的左側肺組織稱重，獲得肺濕重；然后將其在60℃下烘烤72 h后稱量，獲得每個樣品的干重。W/D=濕重/干重。

1.3.6肺組織病理學改變 每只大鼠固定于右肺相同位置切取部分組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肺部病理學變化。

1.3.7肺組織炎性因子檢測 剩余的右肺組織，按照1∶9的比例加入預冷的生理鹽水，研磨后離心，制備10%的肺組織勻漿，ELISA檢測勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-10水平。

1.3.8流式細胞術檢測BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T細胞表面的表達 取1.3.4獲得的外周血細胞懸液100 μl加入流式管中；加入FITC標記抗大鼠BTLA單抗或HVEM單抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，PBS洗滌細胞，離心去上清，加入羊抗鼠PE二抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，再次洗滌細胞，去上清，然后分別加入APC標記抗大鼠CD4單抗和PE標記抗大鼠CD8a單抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，PBS洗滌細胞2次后用0.5 ml懸浮細胞，用流式細胞儀進行雙色標記的方案檢測分析。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1宣白承氣湯對ARDS大鼠一般狀態的影響 空白組精神狀態良好，毛色光滑有光澤，較活躍；模型組精神萎靡，倦怠，毛色暗淡無光澤，活動減少，食欲減退，出現便秘，呼吸困難等現象；宣白承氣湯高、中、低劑量組狀態較模型組發生不同程度的改善，活動、飲食量增加，無明顯呼吸困難現象。

2.2宣白承氣湯對ARDS大鼠P/F、P(A-a)O2的影響 與空白組相比，模型組PaO2、P/F顯著降低，P(A-a)O2顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組大鼠PaO2、P/F明顯升高，P(A-a)O2明顯降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表1。

2.3宣白承氣湯對W/D的影響 與空白組相比，模型組W/D顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組W/D明顯降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表1。

表1 宣白承氣湯對ARDS大鼠P/F、P(A-a)O2、W/D的影響

2.4宣白承氣湯對ARDS大鼠肺組織病理變化的影響 空白組肺組織肺泡結構正常，未見明顯異常；模型組肺體積增大，肺組織結構嚴重受損，肺泡、肺間質水腫，肺泡壁增厚，肺泡間隔增寬，大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔內有出血，部分有透明膜形成；宣白承氣湯高、中劑量組肺組織損傷程度明顯減輕，少量炎性細胞浸潤，未見明顯透明膜形成；宣白承氣湯低劑量組肺組織上述損傷較模型組有所改善，但改善程度低于宣白承氣湯高、中劑量組。見圖1。

圖1 宣白承氣湯對ARDS大鼠肺組織病理變化的影響(HE染色，×200)

2.5宣白承氣湯對ARDS大鼠肺組織炎性因子的影響 與空白組相比，模型組肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-10水平顯著升高，IL-2水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平明顯降低，IL-2、IL-10水平明顯升高(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表2。

表2 宣白承氣湯對ARDS大鼠肺組織炎性因子的影響

2.6宣白承氣湯對ARDS大鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響 與空白組相比，模型組外周血中CD3+、CD4+T淋巴細胞亞群比例及CD4+/CD8+比值均顯著降低，CD8+T值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組外周血中CD3+、CD4+T淋巴細胞亞群比例及CD4+/CD8+比值明顯升高，CD8+T值明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表3。

2.7BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T細胞表面的表達 與空白組相比，模型組外周血CD4+和CD8+T細胞表面BTLA、HVEM表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中劑量組外周血CD4+和CD8+T細胞表面BTLA、HVEM表達明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性(P<0.05)。見表4。

表3 宣白承氣湯對ARDS大鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

表4 BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T細胞表面的表達

3 討 論

有證據表明不同類型的免疫細胞參與了ARDS的發病機制，包括肺泡巨噬細胞(AMs)的極化，嗜中性粒細胞性中毒，輔助性T細胞亞群的促炎反應及調節性T細胞亞群的抗炎和再生作用〔13〕。內毒素是ARDS最重要的危險因素，LPS誘導的大鼠模型模擬了由革蘭陰性桿菌感染或敗血性休克引起的一種ARDS，其病因和生理病理與人類患者非常相似，因此LPS誘導的模型具有重要的現實意義〔14〕。故本研究也采用了LPS進行造模，結果顯示，LPS誘導的ARDS大鼠出現明顯的便秘，呼吸困難等現象，P/F顯著降低，且肺體積增大，肺組織結構嚴重受損，肺泡、肺間質水腫，肺泡壁增厚，大量炎癥細胞浸潤；說明模型制備成功。

中醫認為肺與大腸相表里，宣白承氣湯出自《溫病條辨》，由大黃、(生)石膏、苦杏仁、瓜蔞皮組成，具有清肺定喘，瀉熱通便的功效。其中(生)石膏為君藥，可瀉熱通便、攻積導滯；杏仁宣肺止咳，合用瓜蔞皮同走肺腸，可清肺化痰；且中醫藥治療ALI/ARDS的核心方藥組成中就有大黃、苦杏仁、石膏〔8〕。宣白承氣湯臨床上被廣泛應用于ALI/ARDS、重癥肺炎(痰熱壅肺證)的治療，可改善P/F，降低內毒素和炎癥因子水平〔15,16〕；還可增加重癥肺炎患者血清CD4+、CD4+/CD8+水平，降低CD8+水平，增強免疫〔17〕；動物實驗也表明，宣白承氣湯可影響慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠外周血T淋巴細胞的亞群分布，調節輔助性T淋巴細胞比例〔18〕。有研究發現ALI患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值偏低于正常范圍，CD8+高于正常范圍，出現了免疫抑制，升高患者外周血CD4+/CD8+值，糾正細胞免疫抑制狀態，能降低肺部及全身的炎癥反應，明顯改善肺組織損傷〔19,20〕。IL-2是T細胞增殖所必需的細胞因子，IL-10是重要的炎癥抑制因子，LPS誘導IL-10的分泌增加，可能是由于急性炎癥引起的反饋作用所致〔21〕；且外周血中CD3+、CD4+T淋巴細胞比例及CD4+/CD8+比值顯著降低，CD8+T值顯著升高，說明ARDS大鼠T細胞免疫應答的能力受到抑制；宣白承氣湯可改善ARDS大鼠上述指標的變化；提示宣白承氣湯可增強ARDS大鼠T淋巴細胞免疫功能。

BTLA也稱為CD272，是一種免疫調節受體，主要在B、T和所有成熟淋巴細胞上表達，BTLA抑制T細胞反應和細胞因子產生〔22〕。HVEM為BTLA的特異性配體，BTLA對T細胞的抑制作用強于HVEM對T細胞的積極刺激作用，并防止了T細胞的過度活化〔23〕。BTLA/HVEM信號通路在各種炎癥，自身免疫和感染免疫反應中起著雙向調節作用〔24〕。Zhang等〔25〕發現在腎移植患者中，急性排斥反應接受者的外周CD3+T淋巴細胞中的BTLA表達明顯低于穩定腎移植的對照患者，BTLA過表達可抑制IL-2和IFN-γ的產生并增加IL-4和IL-10的產生，抑制急性排斥反應并調節腎臟移植的同種異體反應。通過阻斷BTLA與HVEM的結合，可激活衰老的CD8+T細胞對流感病毒的應答〔26〕。本研究結果提示宣白承氣湯可下調BTLA/HVEM的表達，增強T淋巴細胞免疫應答能力。

綜上所述，宣白承氣湯可增強ARDS大鼠T淋巴細胞免疫功能，改善肺損傷；其機制可能與BTLA/HVEM的表達下調有關。但是BTLA/HVEM在CD4+和CD8+T細胞表達上調的調控因素及其對T細胞的抑制效應和作用機制有待進一步分析。