草珊瑚不同提取物抑菌活性研究

武文豪，李開杰，王 慶，李丹丹,3，王華磊,3，李金玲,3，羅春麗,3

（1.貴州大學農學院 貴州，貴陽 550025;2.烏當區農業科技園區建設服務中心 貴州，貴陽 550018;3.貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室 貴州，貴陽 550025）

草珊瑚又名腫節風，屬金粟蘭科（Chloranthaceae）植物草珊瑚（Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai）干燥全草，具有清熱涼血，活血消斑，祛風通絡的功效，主治血熱發斑發疹，風濕痹痛，跌打損傷等癥[1]。研究發現在草珊瑚中主要含有黃酮類、萜類、酚酸類、香豆素類、揮發油類等活性成分[2]。藥理學研究表明草珊瑚具有抗菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒及促進骨折愈合等作用[3-6]。

藥用植物抑菌已成為抑菌藥物開發的熱點方向，研究表明大部分清熱解毒藥用植物具有顯著而廣譜的抑菌活性，為篩選天然抑菌藥物指明了方向[7]。劉洋等[8]提出川白芷不同溶劑萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌以及肺炎克雷伯氏菌等均有一定抑菌活性。榮茜等[9]的研究表明黃連、青果、金銀花、金果欖對豬源幽門螺旋桿菌均有很強的體外抑菌活性。此外，知母[10]、大蒜[11]、丹參[12]、五味子[13]等天然藥物的抑菌作用研究也均有報道。貴州地區草珊瑚資源豐富，僅貴州省榕江縣就有5000畝以上天然草珊瑚撫育林，開展草珊瑚抑菌活性研究，對促進黔產草珊瑚進一步開發利用、促進黔草珊瑚產業可持續高質量發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料 本試驗中使的用草珊瑚為2020年采收于貴州省榕江縣水尾鄉（25°71′N，108°20′E），經貴州大學農學院李丹丹老師鑒定該草珊瑚屬于金粟蘭科（Chloranthaceae）植物草珊瑚（Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai）。草珊瑚采收后將其清洗干凈，45℃烘干至恒重，粉樣，過3號篩，備用。

1.1.2 供試菌種及培養基 真菌：小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum schw）、炭疽病菌（Melanconium magnum）、煙草赤霉病菌（Alternariaalternate(Fries)Keisslar）、白術根腐病菌（Fusariμm oxysporμm Schlecht）、須癬毛癬菌（trichophyton mentagrophytes）、紅色毛癬菌（trichophytonrubrum）。

細菌：大腸桿菌(Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。

培養基：PDA固體培養基（真菌用）、LB固體培養基（細菌用）、LB液體培養基。

1.1.3 試驗儀器與試劑 101-3AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化儀器有限公司），高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司），FW-100型粉樣機（北京市永光明醫療儀器有限公司），RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），CP224S型電子分析天平（德國賽多利斯公司），2.5%凱松試劑（山東磊林商貿有限公司），石油醚（30℃～60℃），乙酸乙酯，正丁醇均為分析純（ABCAM公司），試驗所用涂布器，鑷子，打孔器，三角瓶，培養基等器材均在121℃的濕熱環境下滅菌備用。無菌水：由蒸餾水經高壓滅菌鍋121℃下滅菌20min制得。0.1%凱松溶液[14]：由2.5%凱松殺菌防腐劑稀釋制得。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備 采用回流提取法，稱取草珊瑚干燥粉末樣品50g于1000mL圓底燒瓶中，加入500mL蒸餾水回流提取2h，重復提取3次，合并濾液，在其冷卻后過濾，所得濾液取400mL依次使用石油醚（30℃～60℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得萃取液使用旋轉蒸發儀分別旋至浸膏狀，4℃低溫保存所得浸膏。剩余濾液取一小部分保存，留待做草珊瑚粗提液抑菌初篩使用，剩余部分同樣旋干至浸膏狀保存。

1.2.2 菌種活化及菌懸液制備 分別取白術根腐病菌、小麥赤霉病菌、紅色毛癬菌、炭疽病菌、煙草赤霉病菌、須癬毛癬菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的菌種，采用劃線法將各菌種接入已經準備好的PDA固體培養基（真菌）或LB固體培養基（細菌）上，細菌37℃，真菌28℃下培養24h。取活化后的真菌或細菌，挑取部分菌絲或菌斑，接種到含有適量LB液體培養基的試管中，振蕩培養24小時，獲得各種真菌和細菌的菌懸液。

1.2.3 草珊瑚提取物抑菌初篩 取上述活化好的菌懸液50μL于制備好的PDA固體培養基（真菌）或LB固體培養基（細菌）中，用涂膜棒均勻涂布平板表面，使用打孔器在平板上打直徑6mm的孔，去除培養基塊，向孔內注入草珊瑚水取物，每孔30μL，以0.1%凱松試劑為陽性對照，無菌水為陰性對照，每個處理設置3次重復。真菌28℃，細菌37℃下培養24h，觀察有無抑菌圈，并測定抑菌圈大小，取其平均值。

1.2.4 草珊瑚不同提取物抑菌活性 試驗中得到的石油醚萃取物極少，在抑菌活性研究中沒有對其進行考察。使用二倍稀釋法，將上述所得浸膏配制500mg/mL、250mg/mL、100mg/mL、75mg/mL、50 mg/mL濃度梯度的溶液，抑菌方法參照1.2.3節，將不同濃度提取液注入已打孔的培養基內，每個處理設置三個重復，真菌28℃，細菌37℃下培養24h，測量抑菌圈大小，取其平均值。以凱松溶液作為陽性對照。

1.2.5 不同萃取物最小抑菌濃度 依據1.2.4節不同萃取物抑菌活性結果，將各萃取物配制成濃度梯度為20mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、5mg/mL的藥液進行抑菌試驗。抑菌方法參照1.2.3節。

1.3 數據處理

利用Excel2019對原始數據進行處理分析，采用SPASS20進行數據標準誤差分析。

2 結果與分析

2.1 草珊瑚水提物抑菌活性

試驗采用平板打孔法分別考察了草珊瑚水粗提取物對白術根腐病菌、小麥赤霉病菌、紅色毛癬菌、炭疽病菌、煙草赤霉病菌、須癬毛癬菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，經過抑菌初步篩查（見表1），結果發現，草珊瑚水粗提取物對小麥赤霉病菌、炭疽病菌、白術根腐病菌、紅色毛癬菌不能形成抑菌圈，無抑制作用，而對煙草赤霉病菌、須癬毛癬菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌4種菌株有抑菌效果，能形成明顯的抑菌圈，其中草珊瑚水提物對須癬毛癬菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑高于另外金黃色葡萄球菌和煙草赤霉病菌。

表1 草珊瑚水提物的抑菌圈直徑

2.2 草珊瑚不同萃取物抑菌活性

在草珊瑚不同提取物的抑菌活性的試驗中，從表2中可以看出，草珊瑚水提取物和三種萃取物對四種受試菌種表現出不同程度的抗菌效果，通過抑菌圈直徑可判斷草珊瑚不同提取物抑菌活性強弱。其中草珊瑚正丁醇提取物（BE）的抗菌活性最強，水萃取物（SE）的抗菌活性最弱。草珊瑚不同提取物對四種受試菌種的最小抑菌濃度由表2可見，其中草珊瑚提取物對須癬毛癬菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）＞50 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞100 mg/mL；對大腸桿菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）=正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞100 mg/mL；對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）=正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞100 mg/mL；對煙草赤霉病菌的最小抑菌濃度為水提物＞50 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）＜50 mg/mL，水萃取物（SE）＞75 mg/mL。

表2 草珊瑚水提液不同萃取物抑菌活性結果

2.3 不同萃取物最小抑菌濃度

結合表2和表3可以得出草珊瑚不同萃取物對大腸桿菌、須癬毛癬菌、金黃色葡萄球菌以及煙草赤霉病菌的最小抑菌濃度。對須癬毛癬菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）=75 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=20 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）=15 mg/mL，水萃取物（SE）=250 mg/mL；對大腸桿菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）=50 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=15 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）=10 mg/mL，水萃取物（SE）=125 mg/mL；對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）=50 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=正丁醇萃取物（BE）=15 mg/mL，水萃取物（SE）=250 mg/mL；對煙草赤霉病菌的最小抑菌濃度為水提物（AE）=75 mg/mL，乙酸乙酯萃取物（EAE）=15 mg/mL，正丁醇萃取物（BE）=20 mg/mL，水萃取物（SE）=100 mg/mL。結合各類萃取物對四種菌株的最小抑菌濃度綜合分析，四種供試物質的抑菌活性大小為草珊瑚正丁醇萃取物（BE）＞草珊瑚乙酸乙酯萃取物(EAE)＞草珊瑚水提物(AE)＞草珊瑚水萃取物(SE)。

表3 正丁醇及乙酸乙酯萃取物的最小抑菌濃度

3 討論

面對感染性疾病，由于濫用抗生素，致病菌的耐藥性問題日益嚴峻，甚至已經造成了一些不良反應。如長期服用抗生素導致菌群失調和各種不良反應，出現了惡心、嘔吐等胃腸道反應及過敏反應。在試驗選用的幾類菌種中，大腸桿菌是革蘭陰性菌的典型代表，多存在于人和動物的腸道內，在一定條件下會引起多種疾病。金黃色葡萄球菌則為革蘭氏陽性菌的典型，在自然環境中廣泛分布，對人體的感染率僅次于大腸桿菌。須癬毛癬菌在我國新疆少數民族地區多見，是會引起人皮膚癬的一類感染性真菌。在面對這些菌種所引起的各類疾病中，抗生素已經難以成為最優的選擇。人們的目光逐漸轉向非抗生素途徑，藥用植物作為其中的一種，已經成為當前的研究熱點。小麥赤霉病菌、白術根腐病菌、炭疽病等病菌則為植物類病害的常見致病菌，在種植過程中，各類作物經常由于感染這類病菌而導致產量或品質下降等問題。在應對這些致病病害時，目前多采用化學防治，即選用各種農藥進行防治，而農藥開發多注重高效、低殘留，天然藥用植物抑菌的低毒特性也使其成為農藥開發領域的一個重要方向。

草珊瑚是我國的傳統中藥，具有清熱解毒、祛風活血、消腫止痛、抗菌消炎等作用。它具有廣譜抗菌作用，對痢疾桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌等均有抑菌作用[15]，但是否對須癬毛癬菌、煙草赤霉病菌的等菌種具有抑制作用尚未報道。本試驗采用平板打孔法檢測了8種菌種對黔草珊瑚不同萃取物浸膏的敏感性，結果表明黔草珊瑚水提物確對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、須癬毛癬菌和煙草赤霉病菌四種致病菌具有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌效果要遠大于水提物及水萃取物，其最小抑菌濃度均在10～15 mg/mL。這為黔草珊瑚用于開發預防治療大腸桿菌等三種菌株所引起的疾病提供了依據。另外本試驗發現黔草珊瑚對煙草赤霉病菌也具有一定程度的抑制作用。煙草赤霉病作為煙草常見病的一種，對于煙草產量及品質均具有較大影響，試驗發現黔草珊瑚對于煙草赤霉病菌具有抑制作用，此發現對于黔草珊瑚開發煙草病害生物防治農藥具有一定借鑒意義。

在水提物與三種萃取物的抑菌活性比較中，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性均要高于水提物及水萃取物，可能原因為在乙酸乙酯與正丁醇的萃取過程中，草珊瑚的抑菌物質被較大限度的萃取出來。有研究表明從草珊瑚提取物中分離得到的化合物之中，倍半萜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果達到64.5%[16]；香豆素類的異秦皮啶也具有較好的抑菌作用[17]。草珊瑚的乙酸乙酯和正丁醇部位化學成分研究中發現，倍半萜類化合物是草珊瑚乙酸乙酯部位的主要化學成分[18]，正丁醇部位的化合物最主要是香豆素類[19]，這些研究解釋了在草珊瑚水提液中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物研究效果較好的原因，但對于在乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物中究竟是何種化學成分發揮抑菌作用還較為模糊，可以作為進一步的研究方向。