紅霉素抑制PI3K/Akt通路增加Nrf2蛋白表達減輕煙草煙霧暴露下單核細胞炎性反應的效果研究*

孫雪皎，陳 琳，陳 慧，李 程，藍官引

(柳州市人民醫院呼吸與危重癥醫學科，廣西柳州 545006)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是累及肺部及全身的慢性炎癥性疾病，疾病呈進行性發展，嚴重的COPD致殘率及致死率較高，會影響患者生活質量，給患者帶來極大的心理負擔及經濟負擔。煙草煙霧及環境污染等可引起氧化應激，導致氧化損傷，進而直接損傷氣道上皮、加重氣道的炎癥反應，亦可導致蛋白酶抗蛋白酶失衡等，最終導致氣流受限[1-2]。患者脫離氧化應激環境后氣流受限不能完全逆轉，呈持續性的氣流受限，這是導致COPD發生、發展的主要原因之一。

紅系衍生的核因子相關因子2(Nrf2)是具有調節抗氧化基因、維持細胞內氧化還原平衡、抑制凋亡及炎癥等多種生物活性的關鍵轉錄因子，其與多種細胞因子相互關聯，從而發揮多重保護作用[3-4]。Nrf2與氧化應激、炎癥反應、呼吸系統疾病、惡性腫瘤、癌前病變及心血管疾病等的發生、發展有著密切的聯系[5-6]。近年來，研究發現Nrf2在COPD的發生、發展中具有重要作用[7-8]。有研究表明，PI3K信號通路激活Nrf2，進而對抗氧化應激，維持氧化/抗氧化平衡[9]。然而，是否有藥物可以通過作用于Nrf2進而改善COPD患者的炎癥反應，國內外尚無類似研究。作者以此為切入點，以單核細胞株(U937細胞)為研究對象，觀察紅霉素是否能夠通過作用于Nrf2蛋白的表達,減輕煙草煙霧暴露下單核細胞的炎癥反應，同時驗證在單核細胞炎癥反應中，PI3K/Akt通路與Nrf2的關系，以及Nrf2是否受PI3K/Akt通路的調控。本研究將為COPD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

以人U937細胞為研究對象，購于中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1分組

采用煙草煙霧提取物(CSE)制造細胞氧化應激模型，分為以下4組：空白對照組(n=3)，細胞培養液培養U937細胞，不給予紅霉素及CSE干預；CSE組(n=3)，給予CSE刺激細胞過夜；紅霉素組(n=3)，給予紅霉素預孵育2 h后予CSE刺激過夜；抑制劑組(n=3)，給予PI3K/Akt抑制劑LY294002預孵育2 h后予CSE刺激過夜。根據轉染Nrf2-siRNA干擾細胞Nrf2蛋白表達方式，分為以下6組：siRNA NC對照組(n=3)，采用細胞培養液培養，不給予紅霉素及CSE干預；siRNA NC+CSE組(n=3)，給予CSE刺激細胞過夜；NC+CSE+紅霉素組(n=3)，給予紅霉素預孵育2 h后予CSE刺激過夜；Nrf2-siRNA組(n=3)，應用脂質體法Nrf2-siRNA轉染U937細胞，轉染后的細胞應用細胞培養液培養；Nrf2-siRNA+CSE組(n=3)，轉染后的細胞給予CSE刺激細胞過夜；Nrf2-siRNA+CSE+紅霉素組(n=3)，轉染后的細胞給予紅霉素預孵育2 h后予CSE刺激過夜。

1.2.2U937細胞的培養

U937細胞為懸浮細胞，采用由RPMI1640培養基及胎牛血清配置、含10%胎牛血清的培養基培養，于二氧化碳培養箱37 ℃、5%CO2環境中溫育。培養基4 ℃存儲。嚴格按照無菌操作，無菌臺使用前打開紫外燈照射30 min，各種所需的容器、槍頭等物品必須經高壓滅菌消毒后才能用于細胞培養。應用脂質體法Nrf2-siRNA轉染U937細胞。給予PI3K/Akt抑制劑LY294002預孵育2 h后予CSE刺激過夜。

1.2.3CSE的刺激及紅霉素、抑制劑的干預

(1)CSE的制備與應用。將2支去過濾嘴燃燒的香煙煙霧由注射器驅動裝置連續抽吸，將煙霧緩慢通入20 mL無血清的培養基中，制成懸液，放入密封瓶內，搖動使其充分溶解，應用紫外分光光度計(波長320 nm，吸光系數17.5)測量煙草煙霧提取物的濃度。(2)CSE及紅霉素的水平確定。應用Brdu法確定試驗中所應用的CSE及紅霉素水平。(3)紅霉素及抑制劑的干預。紅霉素組給予紅霉素預孵育2 h后予CSE刺激過夜；抑制劑組、CSE組應用細胞培養液代替紅霉素，其余不變；空白對照組應用細胞培養液代替CSE及紅霉素。經以上處理后，離心并獲取上清液及細胞。

1.2.4各項指標的檢測

(1)IL-8水平。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA，武漢華美生物工程有限公司)測定各組細胞上清液中IL-8的濃度。(2)Akt mRNA、Nrf2 mRNA及核因子(NF)-κB p65 mRNA水平。采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測各組細胞中Akt mRNA、Nrf2 mRNA、NF-κB p65 mRNA的表達。(3)Akt、PAkt、Nrf2、NF-κB p65蛋白水平。采用Western blotting檢測各組細胞內Akt、PAkt、Nrf2、NF-κB p65蛋白的表達。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 空白對照組、CSE組、紅霉素組、抑制劑組IL-8水平比較

與空白對照組比較，CSE組IL-8水平明顯升高，紅霉素組、抑制組IL-8水平較CSE組下降(P<0.01)。見表1。

表1 不同細胞氧化應激模型組IL-8濃度比較

2.2 不同細胞氧化應激模型組細胞中Akt mRNA、Nrf2 mRNA及NF-κB p65 mRNA比較

不同細胞氧化應激模型組細胞中Akt mRNA差異無統計學意義(P>0.05)。CSE組Nrf2 mRNA表達較空白對照組下降，NF-κB p65 mRNA表達升高；紅霉素組和抑制劑組Nrf2 mRNA表達有所提高，NF-κB p65 mRNA表達降低。見圖1。

*：P<0.01；#：P>0.05；ns:P>0.05。

2.3 不同細胞氧化應激模型組細胞中Akt、PAkt、Nrf2及NF-κB p65蛋白表達比較

4組細胞中Akt蛋白表達無明顯差異。CSE組Nrf2蛋白達較空白對照組下降，PAkt及NF-κB p65蛋白表達升高；紅霉素組和抑制劑組Nrf2蛋白表達有所提高，PAkt及NF-κB p65蛋白表達降低，但兩組間無明顯差異。見圖2。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶，內參；+：加入；-：不加入。

2.4 不同干擾組中細胞Akt、PAkt、Nrf2及NF-κB p65蛋白表達比較

Nrf2-siRNA組Nrf2蛋白表達較siRNA NC組明顯降低，但與Nrf2-siRNA+CSE組及Nrf2-siRNA+CSE+紅霉素組比較無明顯差異；Nrf2-siRNA組的NF-κB p65蛋白表達較siRNA NC組升高；siRNA NC+CSE組Nrf2蛋白表達較siRNA NC組降低，而NC+CSE+紅霉素組較siRNA NC+CSE組表達升高；siRNA NC組與Nrf2-siRNA組的PAkt蛋白表達無差異，但siRNA NC+CSE組、Nrf2-siRNA+CSE組表達均升高，而NC+CSE+紅霉素組、Nrf2-siRNA+CSE+紅霉素組表達又再度降低。不同干擾組間Akt蛋白表達無明顯差異。見圖3。

+：加入；-：不加入。

3 討 論

Nrf2活化受蛋白磷酸化的調控。目前認為，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI3K、蛋白激酶C(PKC)等信號通路分子廣泛參與了Nrf2的活化和核轉位過程，誘導Nrf2核轉位的信號通路類型與誘導劑、細胞種類等因素相關。有研究表明，PI3K/Akt-Nrf2信號通路激活是兔內毒素休克誘發急性肺損傷時機體的適應性調節機制[10]。然而，在COPD炎癥的發生與發展中，Nrf2的表達如何受PI3K/Akt通路調節尚不明確，是否有抗炎藥物能夠通過作用于PI3K/Akt-Nrf2信號通路減輕COPD的炎癥反應，國內外尚無相關研究。

本研究結果表明，單核細胞經CSE刺激后炎癥細胞因子水平提高，NF-κB p65升高，PI3K/Akt通路關鍵蛋白PAkt表達增加，Nrf2表達下降；經紅霉素干預后炎癥反應減輕，PAkt表達下降，而Nrf2水平升高。應用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002作為本研究的陽性對照，其與紅霉素有同樣的效果。煙草煙霧刺激后單核細胞炎癥反應增加，與PI3K/Akt通路激活、Nrf2蛋白表達下降有關，紅霉素及通路抑制劑均可抑制PI3K/Akt通路活性，提高Nrf2蛋白的表達，進而減輕煙草煙霧暴露下單核細胞的炎癥反應。為進一步證實PI3K/Akt通路與Nrf2蛋白的關系，作者轉染Nrf2-siRNA干擾細胞中Nrf2蛋白的表達，應用siRNA NC組作為對照，結果表明，Nrf2-siRNA組的NF-κB p65蛋白表達較siRNA NC組升高，進一步證明Nrf2表達下降可導致炎癥反應增加；而兩組的PAkt蛋白表達無差異，證明Nrf2的變化不影響PI3K/Akt通路活性。結合前述實驗結果，證明Nrf2在PI3K/Akt下游，受PI3K/Akt通路的調控，紅霉素可通過作用于PI3K/Akt-Nrf2減輕煙草煙霧暴露導致的單核細胞炎癥反應。

國外有研究顯示，Nrf2系統的激活被認為是一種有效的細胞保護策略，可用于治療不同的疾病，例如新型冠狀病毒感染[11]。此外，COPD相關的研究顯示,Nrf2激活劑CPUY192018通過激活Nrf2，在對抗氧化應激和改善代謝方面顯示出顯著效果[12]。在經CSE和脂多糖處理的A549細胞中，DJ-1通過激活Wnt3a/β-catenin信號通路來調節Nrf2介導的MRP1表達和抗氧化防御，以上兩項研究可能在COPD的治療方面提供潛在的靶點和新思路[13]。紫杉醇可能通過刺激Nrf2信號通路來抑制苯并芘所致肺損傷的氧化應激和炎癥反應[14]。由此可見，Nrf2的作用在近年來受到了廣泛關注，值得進一步的研究與探索。

綜上所述，PI3K/Akt信號通路活性及其下游Nrf2蛋白的表達與煙草煙霧暴露的單核細胞炎癥反應表達有關，紅霉素能夠抑制PI3K/Akt通路活性，增加Nrf2蛋白表達，減輕炎癥反應，這將為今后的研究及防治工作提供新思路及實驗依據。