山茶炭疽菌對茶樹的致病性及其對殺菌劑的敏感性研究

程開鑫，楊凱欣，鄧雅元，黎欣，劉恩貝，王玉春,2*，呂務云*

1.浙江農林大學茶學與茶文化學院，浙江 杭州 311300；2.中國農業科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的經濟作物，廣泛種植于全世界多個國家和地區[1-2]。病原菌侵染造成的葉部病害通常會影響茶樹的生長以及茶葉的產量和品質[3-5]。由炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌引起的茶樹葉枯類病害是茶園常見病害之一。病原菌通常從幼嫩葉片背面的氣孔等自然孔口侵入茶樹，潛伏期達1～2周[6]。在侵染早期，被侵染葉片上出現深綠色、水漬狀病斑，之后逐漸發展為較大的棕色病斑，并且病斑聚集[6-7]。侵染后期，病斑邊緣褪色，病斑上產生密集的黑色點狀分生孢子盤，產生的分生孢子可促進病害的傳播[6,8]。此外，炭疽菌也可通過采摘、修剪或風雨形成的傷口侵入茶樹葉片[7]。

炭疽菌屬真菌種類繁多，分布于世界各地，是為害多種植物的病原真菌，通過多基因系統發育學結合形態特征作為炭疽菌種類的鑒定方法已得到全世界的認可[9]。前人已對茶樹炭疽菌的物種多樣性進行了系統研究。Orrock等[10]將分離自美國茶園發病茶樹上的炭疽菌鑒定為山茶炭疽菌（Colletotrichum camelliae）。貢長怡等[11]收集了我國12個省份茶區的茶樹炭疽病病葉，分離得到57株菌株，經過多位點序列和聚類分析發現，山茶炭疽菌和果生炭疽菌（C.fructicola）分離頻率較高。Liu等[6]通過收集我國7個省份茶樹樣品，分離鑒定了11種炭疽菌，認為山茶炭疽菌（C.camelliae）是我國茶樹炭疽菌的優勢種，提出利用ApMat（Apn2-Mat1-2）和GS（Glutamine synthetase）基因構建的多基因系統發育樹，可以準確區分膠孢炭疽菌復合種（C.gloeosporioides complex）的大部分種類。Wang等[12]對收集自全國13個省份茶樹病葉進行分離，鑒定明確了山茶炭疽菌是我國茶樹炭疽病優勢病原菌之一，并對其形態學特征進行了詳細描述，但對于該炭疽菌的致病性及防治方法未深入分析。當前，噴施化學藥劑仍然是防治茶樹病害的主要手段。王國君等[13]分析了4種殺菌劑對茶樹炭疽病的田間防治效果，發現25%吡唑醚菌酯乳油效果最好。He等[14]進一步測試了95%吡唑醚菌酯對4種炭疽菌的藥效，發現其對山茶炭疽菌抑菌有效中濃度（EC50）為0.27 μg·mL-1。貢長怡[15]測定了山茶炭疽菌對苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、甲基硫菌靈和百菌清4種藥劑的敏感性，發現山茶炭疽菌對苯醚甲環唑敏感性較高，EC50分布在0.058 4～0.498 4 μg·mL-1。由于我國茶樹品種多、分布廣，可能造成不同寄主來源的山茶炭疽菌在遺傳進化關系、致病力等方面存在差異，并且殺菌劑對不同來源的菌株是否有差異尚不清楚。

因此，本研究廣泛收集了我國茶葉主產區山茶炭疽菌菌株，并對其地理分布、致病性及其對吡唑醚菌酯的敏感性進行系統分析，旨在為茶樹葉部病害的防治提供科學依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶樹病葉分別于2014—2022年采集自安徽、貴州、河南、湖南、江蘇、江西、陜西、四川、西藏、云南、浙江、廣東、重慶13個省份多個茶區的不同茶樹品種，用于致病性分析的國家級茶樹良種龍井43（LJ43）采自中國農業科學院茶葉研究所茶園。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用單孢分離法分離病原菌[16]。用消毒后的接菌環將病葉上的分生孢子堆刮下，懸浮于無菌水中。將分生孢子懸浮液稀釋至適當濃度后涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，25 ℃黑暗條件下培養過夜。待菌絲長出后，將單個孢子萌發產生的菌絲轉移到新的PDA平板上，繼續純化培養。分離純化后的菌株轉移至PDA斜面后4 ℃保存。

1.2.2 病原菌形態學觀察

菌株在PDA平板上培養5 d后，用滅菌后的打孔器（直徑5 mm）在菌落邊緣打孔，然后轉移至新的PDA平板中央，25 ℃黑暗培養5 d，采用十字交叉法測量并記錄菌落直徑，觀察菌落在PDA平板上的顏色及氣生菌絲生長情況，并拍攝菌落形態。將5～10個直徑5 mm的菌餅接種至100 mL馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB）中，在28 ℃、180 r·min-1搖床中培養誘導產生分生孢子。使用SOPTOP-CX40RFL顯微鏡觀察分生孢子形態，并拍照記錄。每個試驗設置3個重復，并獨立重復3次。

1.2.3 DNA提取及PCR擴增

菌落培養5 d后，采用Ezup柱式真菌基因組DNA純化試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取病原菌菌絲基因組DNA，并存儲于-20 ℃。PCR擴增ApMat和ITS基因片段[17]。PCR引物AMF1為5'-TCATTCTACG TATGTGCCCG-3'，AMR1為5'-CCAGAAATA CACCGAACTTGC-3'；ITS-1F 為5'-CTTGGT CATTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS-4 為5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應體系：25 μL 2×Taq Master Mix，1 μL 10 μmol·L-1上游引物，1 μL 10 μmol·L-1下游引物，22 μL ddH2O和1 μL基因組DNA。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行電泳檢測，將目的條帶樣品送至杭州有康生物科技有限公司進行純化測序。

1.2.4 系統發育樹構建

所有菌株的基因序列在 NCBI網站進行BLAST比對。采用MAFFT v.7進行多序列比對[18]，使用MEGA v.6軟件進行手動校正[19]。利用FastTree軟件以Maximum Likelihood方法構建系統發育樹[20]。

1.2.5 致病性測定

以5年生茶樹LJ43為材料，選取當年生枝條芽下第三、四葉進行接種處理。將健康完整的葉片進行表面消毒后，在葉片正面葉脈左右兩側的葉片表皮上輕劃 4道平行傷口作為接種點。使用5 mm滅菌打孔器，對PDA培養基上28 ℃黑暗培養5 d的菌落進行打孔，菌餅置于葉片的兩處接種點上，對照用相同大小的無菌瓊脂塊處理，每個菌株設3個重復。接種后置于人工氣候培養箱中，28 ℃黑暗保濕培養3 d，觀察發病情況并統計病斑大小。最后，重新對病斑進行分離培養，并與原始接種菌株的形態特征進行比較。

1.2.6 殺菌劑敏感性測定

試驗采用吡唑醚菌酯懸浮劑[有效成分含量為25%，安道麥安邦（江蘇）有限公司]作為處理藥劑。根據He等[14]報道，有效成分含量為95%的吡唑醚菌酯懸浮劑對山茶炭疽菌的EC50為0.27 μg·mL-1，為保證有效成分一致，將本試驗使用的供試藥劑25%吡唑醚菌酯用量換算為同等EC50后，質量濃度為0.284 μg·mL-1。各菌株在PDA平板上培養5 d后，用滅菌后的打孔器（直徑9 mm）在菌落邊緣打孔，新鮮菌餅轉移至含有0.284 μg·mL-1吡唑醚菌酯和100 mg·L-1水楊酸羥肟酸（SHAM）的PDA平板中央，以不含有任何藥劑的PDA平板作為對照，25 ℃黑暗培養5 d后，測量菌落直徑，計算菌絲相對生長抑制率。相對抑菌率計算方法為：相對抑菌率=(C-T)/(C-d)×100%，其中C為對照處理菌落直徑，mm；T為藥劑處理菌落直徑，mm；d為菌餅大小（9 mm）。使用0.284 μg·mL-1吡唑醚菌酯處理菌株的分生孢子，以不含吡唑醚菌酯的分生孢子懸浮液為對照，觀察并統計分生孢子的萌發率。

1.3 數據統計與分析

使用Excel 2018進行數據預處理，利用SPSS軟件單因素方差分析進行顯著性差異檢驗，使用Photoshop CS4進行圖像處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 系統發育學分析

通過對采自中國13個省份茶區的不同茶樹品種病葉進行病原菌分離，共獲得65株山茶炭疽菌菌株（表1），對ApMat和ITS基因序列進行PCR擴增，并構建多基因系統發育樹。結果表明，篩選的65株菌株全部與已鑒定并發表的山茶炭疽菌（C.camelliae）聚類為一族，表明收集的菌株均為山茶炭疽菌（圖1）。

圖1 基于ApMat和ITS聯合構建的山茶炭疽菌多基因系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of C.camelliae based on the ApMat and ITS sequences

表1 菌株采集信息Table 1 Collection information of all isolates

2.2 形態學特征分析

65株菌株在PDA平板上的菌落共有形態表現為呈白色，氣生菌絲致密，絨毛狀，中央凸起，邊緣清晰；背面中央顏色深，四周顏色較淺，灰白色至微黃色（圖2）；菌核、剛毛未見；分生孢子透明，圓柱狀，兩端鈍圓（圖3）。

圖2 65個山茶炭疽菌菌株的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of all isolates C.camelliae

圖3 山茶炭疽菌菌株的分生孢子形態Fig.3 Morphological characteristics of C.camelliae conidia

根據菌落背面的顏色，可將所有菌株分為兩組，組1表現為背面顏色灰白色或中央帶有黑色，包含YCW272、YCW284、YCW304、YCW698、YCW735、YCW1250、YCW1315、YCW1331、YCW1334、YCW1382、YCW1378、YCW1387和YCW1424等13個菌株；組2表現為背面顏色微黃色，包含其余的52個菌株。此外，菌株YCW272、YCW698、YCW1204、YCW1250、YCW1315、YCW1340 和YCW2134的菌落形態與其他菌株稍有差異，即圍繞中央產生一圈大小不一、更致密的白色菌絲（圖2）。各菌株在PDA平板上培養5 d后，各菌落之間菌落直徑存在差異，平均直徑為6.10 cm，其中 YCW1378生長最慢，菌落平均直徑為3.49 cm；YCW1331生長最快，菌落平均直徑為7.85 cm（表 2）。

表2 各菌株的菌落直徑Table 2 Colony diameter of all isolates

2.3 地理分布分析

本研究中，65個菌株有31個采集自浙江省，其中 24個菌株采集自杭州市，6個菌株采集自麗水市，1個菌株采集自紹興市。其余35個菌株采集自其他12個省份，表明山茶炭疽菌地理分布廣泛。

2.4 致病性分析

將65個菌株分別接種于茶樹LJ43離體葉片上進行室內致病性測試。結果表明，有傷處理條件下，所有菌株均能成功侵染葉片；接種24 h后，傷口處出現水漬狀病斑；侵染2 d后，葉片出現深褐色病斑，并隨著接種時間延長，病斑從接種點逐漸擴展，在接種3 d后，病斑擴展為圓形或不規則形，病斑周圍可見黃色至褐色水漬狀暈圈，發病癥狀與田間發病情況基本一致（圖4）。

菌株之間致病力存在顯著差異，其中YCW1180、YCW1331、YCW1382、YCW1387、YCW1419、YCW1443、YCW1451、YCW1453、YCW1454、YCW1461、YCW1613 和YCW2134等12個菌株侵染葉片形成的病斑較大，表明其致病力顯著強于其他菌株。菌株YCW1378侵染形成的病斑最小，平均直徑為3.29 mm，表明其致病力相對于其他菌株最弱（圖5）。

圖5 各菌株的病斑直徑Fig.5 Lesion diameter of all isolates

2.5 殺菌劑敏感性分析

參照He等[14]的研究結果，采用EC50為0.284 μg·mL-1的吡唑醚菌酯處理65個山茶炭疽菌菌株。結果表明，處理3 d后，吡唑醚菌酯對不同菌株的菌絲生長抑制率不同，平均菌絲生長抑制率為72.65%，其中YCW1436菌株的敏感性顯著低于其余菌株，菌絲生長抑制率為36.00%（圖6）。用吡唑醚菌酯處理分生孢子6 h后，顯微鏡觀察發現，與對照組相比，處理后的分生孢子萌發率極顯著下降（P＜0.01），有些菌株的分生孢子甚至不萌發（圖7）。此外，吡唑醚菌酯對大部分菌株的菌絲生長抑制率高于70%，表明吡唑醚菌酯對山茶炭疽菌具有較高的抑菌活性。

圖6 25%吡唑醚菌酯（0.284 μg·mL-1）處理山茶炭疽菌3 d后的菌絲生長抑制率Fig.6 Inhibition rate of mycelial growth under the 25% pyraclostrobin (0.284 μg·mL-1) treatment for 3 d

圖7 25%吡唑醚菌酯（0.284 μg·mL-1）處理山茶炭疽菌分生孢子6 h后的萌發率Fig.7 Rate of conidial germination under the 25% pyraclostrobin (0.284 μg·mL-1) treatment for 6 h

3 討論

葉部病害是威脅茶樹生長和茶葉產品質量的主要影響因素之一[21]。山茶炭疽菌是造成茶樹葉枯類病害的優勢病原菌[12]。自1899年，Massee從斯里蘭卡的茶樹上發現并記錄山茶炭疽菌以來[6,22]，除山茶屬植物以外，該菌種未在其他植物上有報道。Liu等[6]在前人研究基礎上，對山茶炭疽菌的分類學地位和形態學特征進行了重新定義和描述。本研究通過多基因系統發育樹結合形態學特征，從我國13個省份茶區不同茶樹品種病葉中收集鑒定了65株山茶炭疽菌菌株，其菌落特征總體為菌落平整、邊緣整齊、氣生菌絲白色、棉狀、稀疏，與前人報道的菌落形態特征基本一致[6,12]，進一步根據菌落在PDA平板上形成的色素沉積差異，將山茶炭疽菌分為兩組，其中組1背面顏色灰白色，包含13個菌株；組2背面顏色微黃色，包含52個菌株。這種種內不同菌株的菌落形態出現分化的現象，在其他植物病原真菌中已有報道[23-24]。朱名海[25]研究發現，分離自海南南繁區的60個稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）菌株在PDA培養基上的培養性狀不完全一致。許娟[26]對采自安徽省23個地方的小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）的菌絲培養性狀、生長速率等生物學特征差異進行了分析研究，發現23個地方的小麥赤霉病菌在PDA培養基上的顏色大致分為淺紅、紅色、深紅及紅中帶黃。本研究中山茶炭疽菌兩組內的菌株采集自不同地區，其地理分布、茶樹品種和采集地氣候條件等環境因素不同，可能造成山茶炭疽菌具有豐富的遺傳多樣性，因此各菌株的生物學特性存在一定差異。

國家級茶樹良種LJ43選育自浙江龍井群體種，品質優良，適制多種名優茶，是我國茶區主栽品種之一，但該品種對炭疽病表現為高感。近年來，隨著各地茶園的提升改造，伴隨著新品種的引進，又增加了病原菌隨苗木遷移的傳播風險。本研究的致病性分析結果表明，來自不同茶區的山茶炭疽菌對LJ43的致病性存在顯著差異，在12個致病力較強的菌株中，有6個菌株分離自浙江，其他菌株來自重慶、貴州和四川。侵染和抵御侵染兩個過程對病原菌和寄主具有很強的相互選擇作用[27]。因此，我們推測共生茶樹品種的多樣性和較大的地理隔離，可能增強了分離自浙江省茶樹菌株的致病力。

吡唑醚菌酯已廣泛用于防治由炭疽菌引起的植物炭疽病，如辣椒、草莓、高粱和黃瓜等炭疽病防治[28-31]。本研究分析測定了山茶炭疽菌對吡唑醚菌酯的敏感性，在有效中濃度為0.284 μg·mL-1時，吡唑醚菌酯對大部分菌株的菌絲生長抑制率高于70%，表明吡唑醚菌酯對山茶炭疽菌具有較好的室內抑菌效果。此外，吡唑醚菌酯可有效抑制分生孢子的萌發。王國君等[13]研究表明，吡唑醚菌酯對茶樹炭疽病田間防控效果優于其他藥劑。梁碧元等[32]研究發現，25%吡唑醚菌酯對茶樹茶餅病也有著較好的防治效果。此外，吳慶麗等[33]發現，25%吡唑醚菌酯懸浮劑稀釋1 000倍施用后，對茶云紋葉枯病的防效達98%以上。因此，吡唑醚菌酯適用于茶樹葉部病害的防治。

綜上所述，本研究針對分離自中國13個省份茶區不同茶樹品種的65個山茶炭疽菌菌株形態特征和致病性進行了分析，并詳細地分析了山茶炭疽菌不同菌株對吡唑醚菌酯的敏感性。研究結果進一步明確了山茶炭疽菌生物學特性，為后續田間防治奠定了理論基礎。