茶樹腐皮鐮刀菌拮抗菌株的篩選鑒定及促生防病特性分析

鄧曉旭，謝夏，潘婭梅，趙豐華，蔣雙豐，徐文，張潔，孫潤紅，夏明聰，楊麗榮*

1.河南省農業科學院植物保護研究所/河南省生物農藥工程研究中心，河南 鄭州 450002；2.信陽市農業科學院，河南 信陽 464000

茶樹是我國重要的經濟作物，茶葉的出口貿易量近年快速增長[1-2]。茶葉含有茶多酚、茶多糖等多種特有活性物質，具有降血糖、防癌抗癌、抗氧化等功效。世界上已有記載的茶樹病原種類多達 500余種[3]，目前仍陸續有新病害和新病原的報道，例如擬盤多毛孢（Pestalotia theae）引起的茶輪斑病和黑褐色葉斑病，莖點霉屬病原菌（Phoma segeticola var.camelliae和P.herbarum）所引起的茶葉斑病[4-6]，腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）引起的茶樹莖腐和枯萎病等[7]。腐皮鐮刀菌引起的茶樹病害多發于 5月，由分生孢子傳播，在茶樹根莖部發病，自下而上導致葉片逐漸凋落，最終整株樹干枯死[8-9]。茶樹莖腐和枯萎病的發生不僅影響茶樹的生長，還會誘導茶樹次級代謝產物的變化，嚴重影響茶葉的產量和品質，極大損害茶葉的經濟效益[10-11]。

目前，國內外利用生物防治手段抑制由腐皮鐮刀菌引起的植物病害的研究已經取得一定進展。胡嫻等[12]從蘭花根部分離出鉤狀木霉菌（Trichoderma hamatum）LAN2B-1，其發酵液處理后的腐皮鐮刀菌菌絲可溶性蛋白和還原糖含量均顯著降低，對腐皮鐮刀菌的生長抑制率達到 59.38%；Kriaa等[13]從番茄中分離出一種塔賓曲霉菌（Aspergillus tubingensis），該曲霉產生的葡萄糖氧化酶可以抑制腐皮鐮刀菌菌絲的生長和產孢量；Moussa等[14]發現，70%的金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）發酵液可以顯著抑制腐皮鐮刀菌的孢子萌發和菌絲生長，在對甜菜種子進行菌劑包衣處理后，對由腐皮鐮刀菌引起的紋枯病防效顯著；Rojo等[15]的試驗結果表明，Trichoderma harzianum ITEM 3636和T.longibrachiatum ITEM 3635對花生根腐病有明顯的防治效果。目前，茶樹上抑制腐皮鐮刀菌效果較好的菌株尚未見報道。本研究篩選到一株生防效果良好的茶樹內生菌株YB-1476，在此基礎上進一步檢測了菌株YB-1476的促生防病指標，旨在為該菌株的開發應用及茶樹莖腐和枯萎病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

生防菌株篩選所用茶樹葉片于2019年采摘自河南省信陽市新縣茶園，茶樹品種為信陽10號。病原真菌：腐皮鐮刀菌（F.solani），由河南省農業科學院植物保護研究所分離、保藏。

1.2 培養基及培養條件

內生細菌的分離純化采用LB（Luria-Bertani）培養基[16]，平板對峙采用 PDA（Potato dextrose agar）培養基，菌株溶磷測定使用無機磷（NBRIP）培養基[17]，產鐵載體使用鉻天青（CAS）固體培養基[18]，產吲哚乙酸（IAA）能力測定采用Salkowski’s試劑[19]，產纖維素酶使用羧甲基纖維素鈉（CMC）固體培養基，β-1,3-葡聚糖酶活性檢測采用β-1,3-葡聚糖酶檢測培養基。

1.3 試驗方法

1.3.1 內生細菌的分離和純化

茶樹葉片消毒方法：用75%的乙醇浸泡葉片2 min，無菌水沖洗3次，然后用滅菌的剪刀將葉片剪成約0.5 cm×0.5 cm的小片，轉移至無菌研缽中，加入少量的無菌水和滅菌的石英砂進行研磨。將磨碎的樣品分別進行10-1、10-2、10-3梯度稀釋后，分別取50 μL均勻涂布于LB固體培養基上，37 ℃培養，24 h后挑取單菌落在LB固體培養基上劃線。

1.3.2 內生細菌對病原菌的拮抗作用

兩點對峙法：用打孔器在PDA培養基上分別接種直徑0.5 cm的植物病原菌菌餅，在距離病原菌3 cm處對稱點接菌株YB-1476，并將未接內生菌的平皿設置為對照組。28℃恒溫培養5 d后采用十字交叉法測量菌絲直徑，計算菌絲生長抑制率r1。

r1=(Dck—Dt)/Dck×100%

式中，Dck為對照組直徑，cm；Dt為處理組直徑，cm。

1.3.3 菌株YB-1476的鑒定

參照文獻[20]的方法對菌株YB-1476進行形態特征、生理生化特性、革蘭氏染色等試驗。

按照TaKaRa Bacteria Genomic DNA Extraction Kit說明書提取菌株YB-1476的基因組，并采用細菌通用引物27-F（5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492-R（5′-G GTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16 S rRNA基因序列，引物gyrA-F（5′-CAGTCAGGAAA TGCGTACGTCCTT-3′）和gyrA-R（5′-CAAG GTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）擴增gryA基因序列。然后將PCR產物送至尚亞生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果在NCBI數據庫進行比對。采用Mega X進行系統進化樹的構建，抽樣次數為1 000[21]。

1.3.4 菌株YB-1476的生防和促生指標測定

產IAA能力、產鐵載體能力和溶磷能力檢測參考文獻[22]，β-1,3-葡聚糖酶的活性檢測參考文獻[23]，纖維素酶活性的檢測參考文獻[24]。

1.3.5 發酵濾液對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長量的影響

種子液的制備方法：將菌株YB-1476在LB固體培養基上劃線，37 ℃黑暗培養12 h后，用接種環挑取單克隆至5 mL LB液體培養基中，37 ℃，180 r·min-1搖至OD600為0.6作為種子液。

在50 mL的CMC培養基中接入1個直徑為0.5 cm的腐皮鐮刀菌菌餅，28℃，150 r·min-1搖瓶培養5 d后，用濾布將孢子收集到50 mL離心管中，計數后備用。接種1%的YB-1476種子液于LB液體培養基中，37 ℃，180 r·min-1培養20 h，經0.22 μm的細菌過濾器除菌，將發酵濾液稀釋10倍和100倍備用。將孢子加入50 mL的PDB培養基中，將其終濃度調至1.0×105cfu·mL-1。設置3個處理組，分別加入發酵液原液、稀釋10倍發酵液和稀釋100倍發酵液各1 mL，加入等量LB培養基作為對照。28 ℃，150 r·min-1搖瓶培養12 h，將菌絲用濾布過濾收集后于60 ℃的烘箱中烘干，測定菌絲干質量，每個處理3次重復，計算菌絲生長抑制率r2。

r2=(mck—mt)/mck×100%

式中，mck為對照菌絲干質量，g；mt為處理菌絲干質量，g。

1.3.6 揮發性物質對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長的影響

采用平板對扣法進行內生細菌揮發性物質抑菌試驗。在 LB固體培養基平板劃線培養菌株YB-1476，在PDA平板中央接種直徑為0.5 cm的腐皮鐮刀菌菌餅。LB固體培養基在下，PDA培養基在上，兩平板對扣后用封口膜封閉，3次重復，以空白LB平板為對照，28 ℃培養5 d后，十字交叉法測定真菌菌絲直徑，計算菌絲生長抑制率（r1）[25]。

1.4 數據統計與分析

數據采用Excel 2007和SPSS 25進行方差分析，并通過LSD法比較各處理間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離篩選

從健康葉片中共分離出內生細菌56株，通過平板對峙法獲得1株對腐皮鐮刀菌具有明顯抑制效果的菌株（圖1），抑制率為63.31%，編號為YB-1476。

圖1 菌株YB-1476對腐皮鐮刀菌的拮抗作用Fig.1 The inhibitory effect of strain YB-1476 on PDA plate of Fusarium solani

2.2 菌株YB-1476的鑒定

將菌株YB-1476在LB固體培養基上均勻涂布，于37 ℃過夜培養，觀察其菌落形態及顏色。菌株 YB-1476生長狀態良好，菌落直徑較小，白色不透明狀，表面無光澤，易挑起，有腥臭氣味（圖2A）。菌體桿狀有芽孢，為革蘭氏陽性菌（圖2B）。

圖2 菌株YB-1476的單菌落形態和顯微鏡形態Fig.2 Single colonies and microscopic morphology of strain YB-1476

生理生化鑒定結果如表 1所示，結合細胞形態特征和生理生化特性試驗結果，半乳糖、吲哚乙酸、甲基紅、D-木糖和檸檬酸鹽利用試驗為陰性，10% NaCl、D-果糖、甘油、乳糖、纖維二糖、淀粉水解酶、蔗糖、淀粉、明膠水解、V-P試驗和脲酶試驗均為陽性。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步鑒定菌株YB-1476為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表1 菌株YB-1476的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YB-1476

以菌株YB-1476基因組DNA為模板擴增得到16 S rRNA和gyrA基因，將測序結果與GenBank中的序列進行比對。16 S rRNA分析結果顯示，YB-1476與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的相似度為99%（圖3）。gyrA序列分析結果表明，菌株YB-1476的 gyrA序列與貝萊斯芽孢桿菌的同源性達100%（圖4）。基于16 S rRNA和gyrA基因采用鄰接法構建系統進化樹，結果表明，YB-1476與貝萊斯芽孢桿菌處于進化樹的同一分支。因此，將 YB-1476菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 基于16 S rRNA序列構建菌株YB-1476的系統進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain YB-1476 based on16 S rRNA gene sequences

圖4 基于gyrA基因序列構建菌株YB-1476的系統進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain YB-1476 based on gyrA gene sequences

2.3 菌株YB-1476的促生防病指標測定

經過Salkowski比色法測定，YB-1476菌株具有產生IAA的能力（圖5A1和5A2）；YB-1476菌株在CAS培養基上生長，菌落周圍產生黃色透明圈，說明其具有產生鐵載體的能力（圖5B）；其在NBRIP固體培養基、β-1,3葡聚糖酶培養基和CMC培養基上均產生透明圈，說明YB-1476菌株具有溶磷能力和分泌β-1,3葡聚糖酶、纖維素酶的活性（圖5C、5D和5E）。

圖5 菌株YB-1476的促生防病指標Fig.5 Antifungal and growth-promoting traits of strain YB-1476

2.4 菌株YB-1476的抑菌譜

對峙試驗結果表明，菌株YB-1476對平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokinana）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum PH-1）、念珠狀鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）、茄鏈格孢菌（Alternaria solani）均有明顯的抑制作用（圖6），抑菌率分別達(65.03±0.27)%、(42.32±0.23)%、(51.67±0.55)%、(52.33±0.39)%和(63.22±0.40)%。

圖6 菌株YB-1476對不同病原真菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory activity of strain YB-1476 to different pathogens

2.5 菌株YB-1476發酵濾液和揮發性物質對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長量的影響

不同濃度的YB-1476發酵濾液對茶樹腐皮鐮刀菌菌絲生長量均有一定的抑制作用（表2），發酵濾液為原液時，菌絲干質量接近對照的1/3，對菌絲生長量的抑菌率達到66.67%；當發酵濾液稀釋10倍時，菌絲干質量接近對照的1/2，對菌絲生長量的抑菌率達到51.85%；隨著發酵濾液稀釋倍數增加，其抑菌率呈明顯下降趨勢，當發酵濾液稀釋100倍時，仍有18.52%的抑制效果。腐皮鐮刀菌和YB-1476通過對扣法培養5 d后，YB-1476對腐皮鐮刀菌的抑菌率達到53.37%（圖7），說明該菌株的揮發性物質同樣對腐皮鐮刀菌的菌絲生長有明顯的抑制效果。

圖7 YB-1476與腐皮鐮刀菌的平皿對扣試驗Fig.7 Buckle-culture tests between YB-1476 and Fusarium solani

表2 YB-1476發酵濾液不同稀釋倍數對腐皮鐮刀菌菌絲生長的影響Table 2 Control efficiencies of different dilution multiples of the YB-1476 fermented liquid against Fusarium solani

3 討論

目前對茶樹病害常用的防治手段主要有農業防治、化學防治和生物防治。農業防治，包括水肥管理、冬季清園、茶樹修剪等；化學防治主要指噴灑農藥；生物防治是通過抗生素、真菌和細菌等生物資源對茶樹病害進行綜合治理[26-29]。農業防治費時費力，化學防治易產生茶葉農藥殘留問題[30]，生物防治不僅可以降低化學有害藥劑對生態環境的破壞，還可以有效控制作物病害，保證農作物的產量和質量，有利于我國農業健康、可持續發展[31-32]。適量的菌肥可以增加土壤微生物的多樣性，改善土壤環境，緩解外部環境對植物的脅迫[33-36]。目前市面上防治茶樹主要病害的微生物菌肥數量有限，開發新的優質菌肥迫在眉睫，而篩選獲得新的高效生防菌株是菌肥開發的重要前提。

本研究篩選到的對腐皮鐮刀菌拮抗效果顯著的茶樹內生菌株 YB-1476為貝萊斯芽孢桿菌。貝萊斯芽孢桿菌具有生物安全性，對細菌和真菌具有廣譜抑菌效果[37]。夏明聰等[38]研究發現，貝萊斯芽孢桿菌對小麥生長有促生增產效果，同時可以防治小麥紋枯?。籏im等[39]從人參根部土壤分離得到一株Bacillus velezensis AK-0，其次生代謝產物可以有效抑制蘋果果腐病的發生；Jiang等[40]篩選得到B.velezensis 5YN8和DSN012，其次級代謝產物和揮發性物質均對辣椒灰霉病有良好的防治效果。

菌株YB-1476具有產鐵載體和吲哚乙酸、分泌β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶及溶磷的能力。已有研究表明，菌株產生的鐵載體可與有害病原爭奪植物根系周圍土壤中的鐵元素，從而抑制有害病原菌的生長，間接促進植物的生長發育。生防菌產生的吲哚乙酸可以有效降低植物對重金屬的吸收，增加植物對重金屬的抗性，干擾重金屬離子在植物體內的轉運[41-44]。β-1,3-葡聚糖酶和纖維素酶是重要的細胞壁降解酶，能夠降解真菌細胞壁，抑制真菌的生長和繁殖，導致真菌病原體競爭活性下降。同時，水解過程中產生的寡糖也可以作為植物抗病反應的激發因子，全面誘導植物的抗病反應[45-46]。溶磷能力可將土壤中的難溶性磷轉化為可溶性磷，增加土壤中的養分，供植物直接吸收，促進植物的生長。因此推測，菌株YB-1476有效抑制腐皮鐮刀菌生長的同時可能通過促進植株的生長發育，增強茶樹的抗逆性。

研究表明，貝萊斯芽孢桿菌通過非核糖體途徑合成的環狀脂肽類物質芽孢菌霉素D（Bacillomycin D）、豐元素A（Fengycin A）、芽孢柑橘素L（Bacillomycin L）和表面活性素（Surfactin）來抑制真菌菌絲的生長[47-49]。YB-1476的發酵濾液和揮發性物質中均含有抑菌成分，但具體的抑菌物質以及抑菌的機理亟需進一步鑒定和挖掘。