金線蓮細(xì)菌性軟腐病菌的鑒定及生物學(xué)特性

劉建峰， 余瑤， 朱巧玲， 凌丹燕， 胡海濤， 郭威， 路梅*

(1.武義縣俞源鄉(xiāng)人民政府， 浙江 金華 321200； 2.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 金華 321004)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)又名金線蘭、花葉開(kāi)唇蘭，為蘭科(Orchidaceae)開(kāi)唇蘭屬(Anoectochilus)多年生草本植物，喜涼爽、潮濕、沒(méi)有陽(yáng)光直射的環(huán)境，主產(chǎn)于我國(guó)浙江、福建、廣東、臺(tái)灣等地的丘陵地帶和山區(qū)。金線蓮是我國(guó)名貴中藥材，整個(gè)植株都可以入藥，俗稱(chēng)“金草”“藥王”，具有清熱涼血、除濕解毒等藥效[1-2]。此外，金線蓮的葉片卵圓形或卵形，上面暗紫色或黑紫色，具金紅色帶有絹絲光澤的美麗網(wǎng)脈，具有很好的觀賞價(jià)值。

近幾年，因?yàn)檩^高的藥用和觀賞價(jià)值，野生金線蓮的產(chǎn)量已無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求，人工栽培生產(chǎn)規(guī)模逐漸增大。在金線蓮的栽培過(guò)程中，因潮濕的環(huán)境，極易出現(xiàn)多種病蟲(chóng)害，造成重要的經(jīng)濟(jì)損失。軟腐病就是金線蓮苗期的主要病害之一，具有發(fā)病快、傳染性高、危害性強(qiáng)等特點(diǎn)。一直以來(lái)，細(xì)菌性軟腐歐文氏菌黑莖病變種Eruiniacarotovoravar.atroseptica(Hellmers et Dowson)Dye[3]被認(rèn)為是引起金線蓮軟腐病的主要致病菌，其可以通過(guò)氣孔或昆蟲(chóng)、雨水、農(nóng)具等造成的傷口侵入并感染整個(gè)植株。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)引起金華地區(qū)金線蓮軟腐病的致病菌分離鑒定中，發(fā)現(xiàn)菌株J-4能侵染葉片，引發(fā)活體金線蓮軟腐癥狀；經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，該菌株被鑒定為方中達(dá)迪基氏菌(Dickeyafangzhongdai)，并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行了分析，為生產(chǎn)中病害的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

菌株J-4分離自浙江省金華市金線蓮苗木種植基地的軟腐病株。

1.2 病原菌的分離和純化

挑選具有典型軟腐病癥狀的植株材料，先用清水沖洗表面，然后從葉片病健交界處剪取大小0.5 cm×0.5 cm病樣材料，置于1% NaClO溶液中消毒10 min；之后用無(wú)菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸干表面水分后放入EP管中；向管中加入500 μL無(wú)菌水，用無(wú)菌研磨棒將組織輕輕搗碎，靜置15 min；用無(wú)菌水將研磨液稀釋1 000倍，用接種環(huán)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)。28 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察平板菌落生長(zhǎng)情況。將單菌落接種純化培養(yǎng)，純菌接種于4 ℃斜面保存。

1.3 病原菌的致病性檢測(cè)

參照《植病研究方法》(第三版)[4]，選取組培瓶中的圓葉金線蓮幼苗用于試驗(yàn)。供試菌株接種于NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日，用針刺接種法接種，菌液濃度為3×108mL-1。以NB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，重復(fù)3次，每組6～8片葉。處理后的金線蓮苗28 ℃保濕培養(yǎng)。觀察病害的發(fā)生情況，選取發(fā)病癥狀較典型的材料，進(jìn)行病原菌的再分離鑒定。

1.4 生理生化特性分析

在NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌48 h后，觀察病原菌的菌落形態(tài)和光學(xué)顯微下菌體的形狀特征及其大小。

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[5]和《植物病原細(xì)菌鑒定試驗(yàn)指導(dǎo)》(第三版)[6]對(duì)J-4進(jìn)行革蘭氏染色、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V.P.試驗(yàn))、甲基紅(M.R.)試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)，以及明膠液化、吲哚產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、唯一碳源等細(xì)菌純培養(yǎng)鑒定等常規(guī)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行生理生化特性研究。

1.5 分子生物學(xué)分析

1.5.1 DNA提取

挑取NA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的單菌落置于150 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h，得到菌懸液。然后按照TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒方法操作，進(jìn)行DNA的提取。提取后的DNA置于冰箱-20 ℃保存，備用。

1.5.2 16S rDNA序列分析

PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物27 F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492 R(5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT3′)，反應(yīng)體系為25 μL，以NB培養(yǎng)基為模板做陰性對(duì)照。反應(yīng)體系包括2.5 μL 10×PCR buffer，1.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，0.5 μL Taq DNA聚合酶，1.0 μL 10 μmol·L-1上游引物與下游引物，1.0 μL菌液，18 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用美國(guó)UVP公司的GelDoc-IT凝膠成像儀觀察并拍照。PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，并采用軟件MEGA 7.0的Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從而確定病原菌J-4的種類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性檢測(cè)結(jié)果

金線蓮細(xì)菌性軟腐病發(fā)病突然，擴(kuò)展迅速，危害嚴(yán)重。先是苗床植株零星發(fā)病，初始病原從葉片或莖部侵入，形成水浸狀褐色不規(guī)則病斑；隨后病原菌通過(guò)維管束迅速傳播，2～3 d整個(gè)植株呈現(xiàn)軟腐狀態(tài)；并且通過(guò)自然接觸侵染周邊健康植株。7～10 d的時(shí)間，病害擴(kuò)展到整個(gè)苗床，近80%的苗木出現(xiàn)倒伏軟腐現(xiàn)象(圖1中A)。

A—田間自然發(fā)病；B—J-4菌株接種24 h。圖1 金線蓮細(xì)菌性軟腐病癥狀

從采集的病樣中共分離純化得到11個(gè)單菌落，根據(jù)菌落特征(顏色、質(zhì)地等)分成3類(lèi)，分別標(biāo)記為J1-6、X1-3、L1-2。經(jīng)回接健康圓葉幼苗發(fā)現(xiàn)，分離菌株J-4接種活體金線蓮，可以引起和自然發(fā)病相同癥狀的細(xì)菌性軟腐病。接種J-4菌株8 h后，葉片接種部位呈現(xiàn)明顯水漬化，并迅速擴(kuò)散；接種24 h后，接種葉近全葉褐色水漬化，水漬化經(jīng)由葉柄開(kāi)始向莖部擴(kuò)散(圖1中B)。采集圓葉發(fā)病葉片，進(jìn)行病原菌的再分離純化，得到和J-4具有同樣培養(yǎng)性狀的菌株。因此，依照植物病原菌分離鑒定的柯赫氏法則[4]判斷，菌株J-4是引起金華地區(qū)金線蓮軟腐病的主要病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

菌株J-4在NA固體培養(yǎng)基中28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，菌落淺乳黃色、近圓形、有著光滑的表面，相對(duì)于菌落四周而言中央稍凸起，黏性，水浸狀(圖2)。菌體短桿狀，具有運(yùn)動(dòng)性，一般大小為2.0 μm×0.6 μm。

圖2 菌株J-4的形態(tài)特征

2.3 生理生化反應(yīng)

菌株J-4革蘭氏染色為陰性。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株J-4具備在39 ℃以及含有7% NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力。J-4不能水解淀粉、不能分解半胱氨酸產(chǎn)生H2S，在甲基紅試驗(yàn)和V.P.試驗(yàn)中顯示陰性；可液化明膠、分解蛋白胨生成吲哚；可以利用蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、(+)蜜二糖、(+)棉子糖、D-甘露醇、肌醇作為碳源，不能利用D-麥芽糖、古老糖、D-海藻糖、D-塔格糖、D-纖維二糖、α-葡萄糖、D-山梨醇、側(cè)金盞花醇等作為碳源(表1)。

2.4 同源性分析

以菌株J-4的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增和測(cè)序，得到片段大小為1 415 bp的序列(GenBank 登錄號(hào)為OM900031)。在GenBank中進(jìn)行J-4菌株的16S rDNA序列同源性比對(duì)分析，該序列與Dickeyafangzhongdai(OK668082.1、MK400217.2、NR_151914)等菌株序列的同源性高達(dá)99%以上。以KlebsiellapneumoniaeEBT03為外群，用軟件MEGA 7.0構(gòu)建J-4菌株與其相近種屬細(xì)菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖3顯示，溶果膠菌科的迪基氏菌屬(Dickeya)與果膠桿菌屬(Pectobacterium)分別聚在兩個(gè)分支上；迪基氏菌屬中的5個(gè)種(D.fangzhongdai、D.dadantii、D.dianthicola、D.solani、D.zeae)又各自聚在一個(gè)分支上，J-4與D.fangzhongdai聚在一起。因此，結(jié)合其形態(tài)和生理生化性質(zhì)，J-4可鑒定為腸桿菌目(Enterobacterales)溶果膠菌科(Pectobacteriaceae)迪基氏菌屬(Dickeya)中的方中達(dá)迪基氏菌(D.fangzhongdai)。

表1 菌株J-4形態(tài)和生理生化特征

圖3 基于16S rDNA序列同源性的病原菌J-4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

細(xì)菌性軟腐病病原菌主要通過(guò)分泌果膠酶等胞外酶降解寄主植物細(xì)胞壁，導(dǎo)致病組織呈軟腐癥狀，病害迅速擴(kuò)展，成片植物壞死。根據(jù)國(guó)內(nèi)外對(duì)軟腐病的研究發(fā)現(xiàn)，迪基氏菌屬中的多種細(xì)菌，如菊迪基氏菌(D.chrysanthemi)[7]、玉米迪基氏菌(D．Zeae)[8]、茄迪基氏菌(D．solani)[9-10]和方中達(dá)迪基氏菌(D.fangzhongdai)[11]可分別侵染春羽、水稻、土豆、香蕉等多種單子葉或雙子葉植物，引起細(xì)菌性軟腐病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

本文進(jìn)行了浙江省金華市金線蓮細(xì)菌性軟腐病病原菌的分離鑒定，利用傳統(tǒng)細(xì)菌分類(lèi)特征和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，最終確定病原菌為方中達(dá)迪基氏菌(D.fangzhongdai)J-4。D.fangzhongdai是迪基氏菌屬中近幾年才命名的一個(gè)新種，其標(biāo)準(zhǔn)菌株D.fangzhongdaiJS5T于2016年分離自患有樹(shù)干潰瘍病的中國(guó)砂梨(Pyruspyrifolia)[12]。D.FangzhongdaiJS5T為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀、具游動(dòng)性；39 ℃下可以生長(zhǎng)，可分解代謝D-(-)-阿拉伯糖、(+)蜜二糖、(+)棉子糖、甘露醇和肌醇，但不能代謝5-酮D-葡萄糖酸酯和水解酪蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，J-4菌株具有和標(biāo)準(zhǔn)菌株JS5T同樣的生理生化特征。近幾年的國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，D.fangzhongdai不僅可以引起梨樹(shù)的潰瘍病，還可以引起香蕉[11]、蘿卜[13]、半夏[14-15]、蝴蝶蘭[16]等植物的軟腐病，已成為迪基氏菌屬中非常重要的一類(lèi)病原細(xì)菌。

金線蓮喜歡涼爽潮濕的環(huán)境，如海拔為50～1 600 m的常綠闊葉林下或山谷中，不僅生長(zhǎng)于中國(guó)，還分布于日本、泰國(guó)、印度、不丹等國(guó)家[1]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)金線蓮的研究多集中于人工栽培技術(shù)[1-2]、藥物篩選和病害防治[3,17]等方面，對(duì)病害病原菌的分離鑒定研究很少。已報(bào)道的經(jīng)分離鑒定過(guò)的病原菌主要有引起軟腐病的歐文氏菌黑莖病變種(E.carotovoravar.atroseptica)[3]和引起莖腐病的尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchl)[18]等。本文首次對(duì)浙江金線蓮細(xì)菌性軟腐病病原進(jìn)行分離鑒定，為病害的有效防治將提供有用參考。