鐵皮石斛內生真菌及其代謝產物研究進展

方余慧， 曹鵬， 鄒慧熙， 閻秀峰， 李楠

(溫州大學生命與環境科學學院 城市水污染生態治理技術國家地方聯合工程研究中心 浙江省水環境與海洋生物資源保護重點實驗室， 浙江 溫州 325035)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科(Orchidaceae)多年生草本植物，廣泛用作傳統藥材[1]，被譽為“九大仙草之首”[2]。據《中國藥典》記載，鐵皮石斛內含豐富的活性物質，具有多種生物學功效。現代醫學大量研究也表明，石斛中含有豐富的多糖、生物堿、氨基酸、酚類等活性成分[3]，具有抗氧化、抗菌、抑制腫瘤、保肝、抗炎等作用[4]。隨著現代生物技術的快速發展，人們對鐵皮石斛的認識和研究也在逐步深入，這為鐵皮石斛的產業化種植提供了理論基礎。盡管鐵皮石斛在我國入藥歷史悠久，但其生長緩慢，病害時常發生，嚴重影響鐵皮石斛的產量和品質。目前，生產上對于鐵皮石斛病害的防治仍以化學農藥防治為主，但長期使用會引起農藥殘留、破壞原有植物內外部生態平衡、病菌耐藥性增強等一系列問題[5]。而研究表明，以內生真菌制備的生防菌制劑不僅具有抗病促生長、長效無污染等諸多優點，且適用于工業化、規模化生產。

內生真菌是指定殖在寄主植物健康組織內，且不引起植物發病的真菌微生物[6]。研究表明，內生真菌可以促進植物健康生長，其代謝產物的生物活性也已在多種植物中得到證實[7]。內生真菌能通過提高養分利用率、固定生物氮和產生植物激素直接促進植物生長[8]，也能拮抗有害微生物，并通過抗菌、競爭或提高系統性抗性等方式間接保護植物健康。內生真菌在鐵皮石斛的病害防治、人工栽培、引種馴化以及資源再生和保護等方面都具有重要的應用價值和前景[9]。本文重點梳理已分離鑒定的鐵皮石斛內生真菌多樣性及其共生關系，概括內生真菌對鐵皮石斛生長發育及病害防治的作用，并歸納其代謝產物的生物學活性，推動鐵皮石斛規模化栽培、病害的綠色防治以及藥用價值的開發利用，促進石斛產業可持續發展具有長遠的現實意義。

1 鐵皮石斛內生真菌的多樣性

鐵皮石斛含有豐富的內生真菌，其涵蓋了半知菌亞門(Deuterornycotina)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)和子囊菌亞門(Ascomycotina)[10]。學者們從鐵皮石斛中分離得到的主要內生真菌種屬如表1所示，不同分離部位及產地均存在一定差異。

從2000年開始，郭順星等[11]從四川、云南、福建的野生鐵皮石斛根部分離得到內生真菌14株，建立了石斛屬內生真菌分離和鑒定的方法，開啟了鐵皮石斛內生真菌的研究。Zhou等[12]從廣西鐵皮石斛中分離得到28株內生真菌，結果顯示，分離的內生真菌分別歸屬于鐮刀屬(Fusarium)，赤霉菌屬(Gibberella)，小球殼孢屬(Microsphaeropsis)，鏈格孢屬(Alternaria)，黑孢屬(Nigrospora)，炭疽屬(Colletotrichum)，小叢殼菌屬(Glomerella)等10個屬。

表1 鐵皮石斛內生真菌分類

胡克興等[13]采用形態學鑒定和分子生物學鑒定的方法，結合菌落培養特征和分生孢子大小、顏色、形態和產孢結構類型等顯微特征以及內轉錄間隔區序列(ITS)進行系統發育分析，對鐵皮石斛生長活性的內生真菌進行鑒定，確定其分類地位。他們從鐵皮石斛的根、莖和葉中分離得到67株內生真菌，分別歸屬于16個屬，其中Fusarium和Alternaria為鐵皮石斛內生真菌的優勢種群。其內生真菌在鐵皮石斛根、莖、葉中的分布存在較大差別，具有一定的組織差異性。Hou等[14]分離得到8株內生真菌，分別屬于擬盤菌屬(Pestalotiopsis)，曲霉菌屬(Eurotium)，棘殼孢屬(Pyrenochaeta)，鬼傘屬(Coprinellus)，鱗傘屬(Pholiota)，柔膜菌屬(Helotiales)，鏈格孢屬(Alternaria)，他們對鐵皮石斛幼苗有促進生長作用。毛益婷等[15]研究表明，野生鐵皮石斛內生真菌的種類和數量在根、莖、葉中的分布具有明顯差異。

由此可見，對于鐵皮石斛內生真菌的多樣性體現在多個維度，包括菌種多樣性和分布多樣性。豐富的微生物多樣性直接影響了植物健康和生長發育。因此，研究鐵皮石斛內生真菌多樣性具有深遠意義。

2 鐵皮石斛與其內生真菌的互作關系

2.1 內生真菌對鐵皮石斛抗病害的影響

研究表明，許多內生真菌可以通過與病原菌競爭生態位和營養物質產生抗菌代謝物，作為植物防御的組成部分并誘導植物產生抗微生物或免疫化合物等途徑使病原菌無法得到正常的營養供給而消亡，從而增強宿主抵御病害的能力[16]。目前，有研究表明,內生真菌對嚴重危害鐵皮石斛產量和質量的白絹病、炭疽病、圓斑病均有顯著的抑制作用。

白絹病又稱菌核性根腐病或菌核性苗枯病，危害苗木和幼樹的根莖部，影響水分和養分的吸收，導致植物生長不良，嚴重時枝葉全部枯萎死亡，嚴重危害鐵皮石斛的品質及產量[17]。研究表明，鐵皮石斛白絹病是由齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)和翠雀小核菌(Sclerotiumdelphinii)引起的[18]。周瑩等[19]從鐵皮石斛中篩選得到6株可以較好抑制翠雀小核菌活性的內生真菌，其中Trichodermapolysporum抑制作用最強，可以定殖在鐵皮石斛根、莖、葉等組織，有效抑制白絹病的發生。

炭疽病主要危害鐵皮石斛的嫩葉，也可導致莖部腐爛及折斷[20]。研究結果表明，從鐵皮石斛中分離出對石斛炭疽病的病原菌——膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)具有較強的抑制效果的內生真菌[21-22]，其中菌株Ceriporiasp. F102、Rigidoporussp. F27、Termitomycessp. F103和Peniophorasp. F122的抑制率均高于80%。

圓斑病嚴重危害鐵皮石斛的葉片，導致葉片脫落。李梅蓉等[23]發現，鐵皮石斛內生真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)對圓斑病的致病菌——露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)的菌絲生長有較好的抑制作用，且持續時間較長。

由此可見，內生真菌可以幫助宿主鐵皮石斛適應生物脅迫，增強其抵御病害的能力。

2.2 內生真菌對鐵皮石斛生長發育的影響

研究表明，石斛內生真菌在寄主植物細胞內交叉傳遞，在植物寄主的生長發育、抗性以及各種生物刺激和脅迫中發揮重要作用[24]。大多數內生真菌來源于其寄主植物的生長環境，包括根際微生物、飄浮在空氣中的真菌孢子以及昆蟲和動物的攝食過程[25-26]。這些內生真菌可以侵入植物根表皮細胞并定殖于細胞內，形成厚壁孢子或高度分叉的菌絲，誘導寄主植物產生吲哚乙酸等各種生長激素，引發根系分支，增加根系吸收面積，提高植物攝取土壤養分的能力，從而增加宿主植物的株高、干重等，促進提前開花，因此，內生真菌對促進植物生長具有重要的意義[27]。

高微微[28]將植物的原球莖、試管苗與內生真菌開唇蘭小菇、石斛小菇和蘭小菇進行雙重培養，監測到原球莖有明顯增殖，鐵皮石斛苗的生長量高于對照3～5倍，說明小菇屬內生真菌能夠促進鐵皮石斛原球莖及幼苗的生長。朱彥明等[29]從石斛根部分離到毛殼菌屬(ChaetomiumKunze)、蠟殼耳屬(Sebacina)、踝節菌屬(Talaromyces)3種真菌，對鐵皮石斛種苗生長發育都有顯著的促進作用。同時，研究者將鐵皮石斛接種到有瘤菌根菌液的培養液中，發現鐵皮石斛生長更加旺盛并且營養成分顯著提高，極大促進了鐵皮石斛組培苗的生長[30-31]。

由此可見，有效內生真菌與鐵皮石斛共培養可縮短鐵皮石斛生長周期，增加其中藥材資源的應用。

3 鐵皮石斛內生真菌代謝產物及其作用

許多內生真菌可以代謝產生多種具有生物活性的天然化合物，這些化合物可直接或間接應用于各種疾病的治療。自Stierle等[33]從植物內生真菌中提取出具有抗癌作用的活性物質紫杉醇以來，內生真菌及其代謝產物的生物活性便引起了廣泛關注。

研究表明，內生真菌可以產生多種生物活性代謝物，包括萜類、醌類、吲哚生物堿、聚酮化合物和非核糖體肽類等[34]。Yu等[35]采用高效液相色譜法和紫外分光光度計法對鐵皮石斛內生真菌的菌絲體或發酵液中的糖類和黃酮類化合物進行檢測，結果表明，21種真菌的乙酸乙酯提取物均含有黃酮類化合物，其中菌株DO49產生柚皮素，菌株DO23、DO81和DO83產生蘆丁，21株菌株的水溶性提取物均含有多糖。Wu等[36]從鐵皮石斛內生真菌Pestalotiopsis代謝產物中分離得到2種新的具有抗真菌活性和細胞毒性的單萜類化合物以及3種已知化合物，其中4種化合物對白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌、煙曲霉均顯示出顯著的抗真菌活性。徐迪等[37]從鐵皮石斛內生真菌發酵液中分離得到15個環肽和苯環衍生物，其中3種具有一定的腫瘤抑制活性。

內生真菌代謝產物可在一定程度上促進鐵皮石斛生長，對石斛的組成成分、生物活性和藥理活性等產生一定的影響。楊慧等[38]研究表明，鐵皮石斛內生真菌代謝產物可促進鐵皮石斛生長，且代謝產物加入的時間不同會對鐵皮石斛產生不同作用，具體表現在培養后期加入代謝產物對原球莖生長有促進作用，前期加入則對原球莖生長有抑制作用。林艷君等[39]用尖孢鐮刀菌誘導子處理鐵皮石斛原球莖，成功提高了石斛生物堿含量，且當誘導子濃度為200 mg·L-1時，總生物堿含量達到最大值，表明內生真菌誘導子作為一種特定的化學信號，可以誘導特定基因的表達，在一定程度上影響調光系統，增強植物光合作用，從而活化特定的代謝途徑，促進代謝產物的合成和積累。

此外，內生真菌自身也能夠產生與寄主植物相同或相似的代謝產物，可持續地獲得活性物質，從而擺脫農田、季節中的不利因素和病蟲害的限制。研究者從鐵皮石斛內生真菌獲得了多種與宿主多糖結構相似的內生真菌多糖，具有良好的抗氧化和免疫調節活性，由于其成本效益和環境友好的特點，是極具商業競爭潛力的天然產物[40-47]。

綜上所述，鐵皮石斛內生真菌的代謝產物不僅能促進鐵皮石斛生長，增加其藥用成分的合成與累積，更具有抗真菌、抗氧化、腫瘤抑制和免疫調節等活性，富含巨大的藥用潛能，有待科研人員對其進行多角度、多廣度、多深度的研究與應用。

4 問題與展望

鐵皮石斛內生真菌具有豐富的多樣性，其代謝產物蘊含巨大的開發潛能。已有大量的研究報道其代謝產物具有促生長、抗真菌、抗氧化、腫瘤抑制和免疫調節等活性。因此，研究鐵皮石斛內生真菌及其代謝產物，對鐵皮石斛的實際生產應用具有重要的意義和價值。

目前鐵皮石斛內生真菌的分離鑒定方法已較為成熟，已報道的鐵皮石斛內生真菌種類較多，但對于其內生真菌的研究還存在以下不足：(1)隨著分子生物學技術的發展，可以擺脫一些依靠形態學鑒定的不確定性，但對于一些難以培養的內生真菌，其分離鑒定仍是一大難題；(2)初步的研究表明，內生真菌可以促進鐵皮石斛的生長發育及協助抗病害，但對其促生及抗病機制研究較少且不深入；(3)由于內生真菌的多樣性及復雜性，對其代謝產物的種類、功能及其生理活性還知之甚少，對其生物合成路徑、作用機制尚不明確。

面對這些難題，今后對于鐵皮石斛內生真菌的研究應包括以下幾個方面：(1)發展高通量測序技術，有針對性分離特異內生真菌；(2)探討鐵皮石斛內生菌與其共生關系，明確其與宿主植物相互作用的機理；(3)挖掘內生真菌及其代謝產物，篩選分離出能產生與鐵皮石斛相同或相似生理活性成分的內生真菌，對這些活性成分進行規模化發酵以獲取工業化生產的產物，進一步探索其生物合成途徑。

隨著鐵皮石斛產業飛速發展，關于其內生真菌的研究也在逐步深入。通過開發綠色、安全、有效的內生真菌及其代謝產物，拓展其在農業生產、醫藥學材料等方面的應用，可以為鐵皮石斛內生真菌及其代謝產物的藥理作用研究和新藥開發提供參考。