基于Nrf2/HO-1信號通路的壽胎丸對復發(fā)性流產(chǎn)大鼠的影響

申思楠 ，牟珍妮 ，唐麗 ，喬宗惠 ，雷磊

1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410021

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）指在妊娠28周之前發(fā)生3次或3次以上的胎兒丟失，且隨著墮胎次數(shù)增加，復發(fā)的風險亦增加[1-3]。RSA病因復雜，常見原因有解剖異常、病原微生物感染、內分泌代謝異常、自身免疫性疾病等，但50%以上的RSA無法明確其致病原因，稱為原因不明復發(fā)性流產(chǎn)（URSA）。目前認為，URSA主要與免疫失衡有關[4-6]。在正常妊娠中，機體處于氧化與抗氧化平衡狀態(tài)，當機體活性氧（ROS）增多或抗氧化功能減弱時，氧化與抗氧化平衡被打破，導致流產(chǎn)發(fā)生[7-8]。核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）介導的信號通路是機體抗氧化應激的重要通路，在維持機體氧化與抗氧化平衡中發(fā)揮重要作用[9]。

根據(jù)其臨床特點，RSA屬中醫(yī)學“滑胎”“數(shù)墮胎”范疇。滑胎見于《產(chǎn)經(jīng)》“治數(shù)落胎方：作大麥豉羹食之，即安胎。又方：取母衣帶三寸燒末，酒服即安”。其病機多為先天不足，腎氣虛損，以致不能蔭胎系胎；或脾虛中氣虧損，化源匱乏，不能攝養(yǎng)胎元。壽胎丸出自《醫(yī)學衷中參西錄》，由炒菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠組成，能補腎固沖安胎，為治療滑胎的經(jīng)典方。前期研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮安胎功效[10-12]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸主要成分槲皮素可通過逆轉抗氧化酶表達、升高血紅素氧合酶1（HO-1）表達，促進妊娠期抗氧化應激反應，減少氧化應激損傷[13]，這可能是其發(fā)揮安胎作用的機制之一。基于此，本研究從Nrf2/HO-1信號通路探討壽胎丸治療RSA的作用機制，為壽胎丸治療RSA提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠32只、雄性SD大鼠16只，7～8周齡，體質量240～250 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度（22±2）℃，濕度50%±5%，12 h光暗交替。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（LL2020070104）。

1.2 藥物

壽胎丸（炒菟絲子6 g，桑寄生3 g，續(xù)斷3 g，阿膠3 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，由藥劑科主任戴冰教授鑒定為正品。地屈孕酮片，10 mg/片，批號364221，荷蘭Abbott Biologicals B.V.。米非司酮片，25 mg/片，批號190907，浙江仙琚制藥股份有限公司。羥基脲片，0.5 g/片，批號0E0483D05，齊魯制藥有限公司。以上藥物按前期方法[11]配制成相應溶液。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素、伊紅染色液（北京中杉金橋，貨號分別為ZLI-9610、ZLI9613），ROS ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號JL21051），RIPA裂解液（北京康為世紀，貨號CW2333S），蛋白酶抑制劑（北京康為世紀，貨號為CW2200S），磷酸酶抑制劑（北京康為世紀，貨號CW2383S），BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢伊萊瑞特，貨號E-BC-K318-M），Nrf2抗體（美國Affinity公司，貨號AF0639），HO-1抗體（美國Affinity公司，貨號AF5393），醌氧化還原酶1（NQO1）抗體（美國Affinity公司，貨號DF6437），GAPDH抗體（美國Affinity公司，貨號AF7021），超純總RNA提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，貨號5003050），NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，貨號E047），NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus（蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，貨號E096）。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17超速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），Cytation 3多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司），T100TMThermal Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，參照文獻[14]方法建立RSA模型，將32只SD雌鼠和16只SD雄鼠合籠飼養(yǎng)過夜，次日早晨觀察雌鼠有無陰道栓脫落，并采集雌鼠陰道分泌物進行涂片，當觀察到雌鼠有陰道栓脫落且陰道分泌物涂片在顯微鏡下可見大量精子時將其作為妊娠第0日。將32只孕鼠隨機分為正常妊娠組、模型組、地屈孕酮組和壽胎丸組，每組8只。模型組、地屈孕酮組和壽胎丸組妊娠第1～9日下午予羥基脲溶液450 mg/kg灌胃，妊娠第10日上午予米非司酮溶液4.0 mg/kg灌胃；同時，妊娠第1～9日上午，壽胎丸組予壽胎丸藥液0.5 g/kg灌胃，地屈孕酮組予地屈孕酮溶液3.02 mg/kg灌胃，模型組和正常妊娠組予等量生理鹽水灌胃。

2.2 取材

米非司酮溶液灌胃2 h后，稱量大鼠體質量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血后脫頸處死大鼠，分離子宮。于子宮角處鈍性分離子宮壁，將胚胎及胎盤從著床位置剝離，用眼科剪將著床部位蛻膜組織剪下，PBS漂洗后吸干水分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，剩余部分以液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 指標檢測

2.3.1 子宮臟器指數(shù)

取出子宮，預冷PBS清洗干凈，吸水紙吸干水分，稱量子宮質量，計算子宮臟器指數(shù)（子宮質量÷體質量×100%）。

2.3.2 胚胎丟失率

參照文獻[15]方法，取出子宮組織，觀察胚胎發(fā)育情況，計算胚胎丟失率（丟失胚胎數(shù)÷胚胎總數(shù)×100%）。

2.3.3 HE染色

取出多聚甲醛固定的蛻膜組織，脫水、包埋后制成4 μm石蠟切片，切片脫蠟復水，蘇木素浸染5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，流水返藍1 h，烘干，伊紅浸染3 min，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.3.4 ELISA檢測

將全血3 000 r/min離心20 min（離心半徑6 cm），取上層血清，按ELISA試劑盒說明步驟操作，以空白孔調零，波長450 nm處測定各孔吸光度（OD值），根據(jù)標準曲線計算ROS含量。

2.3.5 Western blot檢測

取蛻膜組織，加入RIPA裂解液，勻漿、研磨提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調整蛋白濃度為2 μg/μL。配制10%分離膠，每孔10 μL蛋白上樣，凝膠電泳分離（80 V、120 min），200 mA轉膜90 min，5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，滴加Nrf2、HO-1、NQO1一抗（均為1∶2 000）和GAPDH一抗（1∶20 000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，滴加二抗（1∶10 000），37 ℃孵育 h，TBST漂洗3次，ECL顯影液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，用Image Lab 6.0.1軟件分析目的蛋白灰度值。

2.3.6 RT-qPCR檢測

使用超純總RNA提取試劑盒提取蛻膜組織總RNA，測定RNA濃度及純度后，將RNA反轉錄為cDNA，配制RT-qPCR反應體系：NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃、20s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 壽胎丸對模型大鼠子宮臟器指數(shù)的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠子宮臟器指數(shù)顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，壽胎丸組大鼠子宮臟器指數(shù)顯著升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠子宮臟器指數(shù)比較（±s，%）

表2 各組大鼠子宮臟器指數(shù)比較（±s，%）

注：與正常妊娠組比較，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)8 8 8 8子宮臟器指數(shù)1.37±0.20 0.69±0.16★★1.09±0.12 1.27±0.15*

3.2 壽胎丸對模型大鼠胚胎丟失率的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠胚胎丟失率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組大鼠胚胎丟失率顯著降低（P<0.05）。壽胎丸組與地屈孕酮組胚胎丟失率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠胚胎丟失率比較（±s，%）

表3 各組大鼠胚胎丟失率比較（±s，%）

注：與正常妊娠組比較，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)8 8 8 8胚胎丟失率12.56± 5.35 72.09±19.98★★30.57±14.93*22.38± 4.10*

3.3 壽胎丸對模型大鼠蛻膜組織病理形態(tài)的影響

正常妊娠組大鼠蛻膜細胞排列緊密，胞質豐富、呈紅色，細胞核呈卵圓形，核仁大而明顯、呈藍紫色，間質血管豐富，管壁完整；模型組大鼠蛻膜細胞胞漿水腫，部分細胞核消失，間質血管分布減少；地屈孕酮組較模型組有所改善，但仍可見部分蛻膜細胞胞漿水腫，間質血管分布較少、管壁完整；壽胎丸組大鼠蛻膜細胞核形態(tài)更趨于正常妊娠組，細胞核基本無固縮、消失、壞死。見圖1。

圖1 各組大鼠蛻膜組織形態(tài)（HE染色）

3.4 壽胎丸對模型大鼠血清活性氧含量的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠血清ROS含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組大鼠血清ROS含量顯著減少（P<0.05，P<0.01）；與地屈孕酮組比較，壽胎丸組大鼠血清ROS含量顯著減少（P<0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清ROS含量比較（±s，U/L）

表4 各組大鼠血清ROS含量比較（±s，U/L）

注：與正常妊娠組比較，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與地屈孕酮組比較，▲▲P<0.01

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)6 6 6 6 ROS 8.61±2.12 36.56±4.36★★31.32±6.53*15.29±2.73**▲▲

3.5 壽胎丸對模型大鼠蛻膜組織核轉錄因子E2相關因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1蛋白表達的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達顯著降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，壽胎丸組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達顯著升高（P<0.05，P<0.01），地屈孕酮組大鼠蛻膜組織Nrf2、NQO1蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見圖2、表5。

圖2 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達比較（±s）

注：與正常妊娠組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)3 3 3 3 Nrf2/GAPDH 1.05±0.16 0.37±0.05★★0.91±0.12*0.88±0.13*HO-1/GAPDH 1.17±0.07 0.44±0.10★★0.51±0.11 1.05±0.17**NQO1/GAPDH 0.79±0.15 0.46±0.04★0.88±0.16*1.04±0.25**

3.6 壽胎丸對模型大鼠蛻膜組織核轉錄因子E2相關因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1 mRNA表達的影響

與正常妊娠組比較，模型組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達顯著降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，地屈孕酮組和壽胎丸組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）。見表6。

表6 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達比較（±s）

表6 各組大鼠蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達比較（±s）

注：與正常妊娠組比較，★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別正常妊娠組模型組地屈孕酮組壽胎丸組只數(shù)3 3 3 3 Nrf2 1.00±0.01 0.64±0.10★★0.78±0.08*0.89±0.03**HO-1 1.01±0.16 0.08±0.01★0.26±0.01**0.77±0.06**NQO1 1.00±0.08 0.66±0.01★★1.00±0.10**1.06±0.05**

4 討論

腎主生殖，“胞絡者系于腎”（《素問·奇病論篇》），腎為先天之本，藏精，主生殖，胚胎的正常發(fā)育離不開腎精的滋養(yǎng)和腎氣的固護。壽胎丸君藥菟絲子陰中有陽，守而能走，補腎養(yǎng)精，益陰而固陽；臣藥桑寄生補肝腎，養(yǎng)血而固沖任，安胎；續(xù)斷補益肝腎，調理沖任，有固本安胎之功；阿膠補血滋陰，使沖任血旺，則胎氣自固。四藥合用，以補腎益精為主，養(yǎng)血滋陰，腎氣充足亦可推動脾的運化，脾旺則水谷運化正常，水谷之精亦可滋養(yǎng)腎精，使腎氣充盛，血海充盈，沖任通利，胎氣得固。

RSA發(fā)生與氧化應激密切相關。當氧化應激產(chǎn)物堆積時，機體的蛋白質合成受到抑制，血管內皮損傷，影響胚胎正常著床[16]。此外，ROS過度堆積還會影響卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育，增加流產(chǎn)發(fā)生率[17]。ROS是細胞代謝的正常產(chǎn)物，主要在線粒體內膜上的電子傳遞鏈中產(chǎn)生，在維持細胞增殖和內環(huán)境穩(wěn)定中起關鍵作用[18-19]。正常生理狀態(tài)下，機體內ROS的產(chǎn)生和消除保持一定平衡，當ROS在體內過度累積則會對細胞造成損傷[20-22]。內外環(huán)境刺激導致ROS過量產(chǎn)生時，Nrf2被激活并易位到細胞核，識別并激活抗氧化反應元件，進而誘導下游NQO1、HO-1等抗氧化蛋白表達以對抗氧化應激反應[23]。Nrf2是維持細胞氧化還原平衡的關鍵調節(jié)因子和Ⅱ相解毒酶的主要轉錄因子[24-25]。HO-1和NQO1是體內重要的抗氧化劑和Ⅱ相解毒酶，在體內發(fā)揮重要的抗氧化作用[26]。NQO1同時也是輔酶Q和維生素E的還原酶，可通過維持輔酶Q和維生素E的還原狀態(tài)發(fā)揮抗氧化應激作用[27]。Nrf2信號通路是機體重要的抗氧化應激通路，對妊娠早期機體發(fā)生的氧化損傷具有保護作用，通過促進下游基因HO-1表達防止流產(chǎn)發(fā)生[28-29]。Luan等[8]發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2/HO-1通路可以抑制流產(chǎn)患者絨毛膜滋養(yǎng)層細胞氧化應激和細胞凋亡。

本研究中，模型組大鼠胚胎丟失率顯著升高，子宮臟器指數(shù)顯著降低，蛻膜組織可見細胞核消失、胞漿水腫、血管分布減少，提示RSA大鼠模型制備成功。壽胎丸治療能明顯降低模型大鼠胚胎丟失率，改善蛻膜組織病理形態(tài)，降低血清ROS含量，促進蛻膜組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白和mRNA表達，提示壽胎丸可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，使氧化-抗氧化系統(tǒng)恢復平衡狀態(tài)，發(fā)揮安胎作用。本研究結果進一步說明Nrf2/HO-1信號通路在RSA中的重要作用，以及壽胎丸治療RSA的作用機制。在后續(xù)實驗中將繼續(xù)對該通路下游抗氧化蛋白進行檢測，進一步明確其作用靶點，為壽胎丸的臨床應用提供實驗基礎。