補腎安胎沖劑含藥血清對復發性流產小鼠胎盤滋養細胞功能、血管內皮生長因子及其受體表達的影響

侯阿美 ，王肖莉 ，張意林 ，劉敏 ，梁雪寶 ，儲繼軍

1.安徽中醫藥大學 安徽 合肥 230038； 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽 合肥 230031

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠早中期連續發生≥3次的自然流產[1]。近年來RSA發病率呈增長趨勢，約占育齡期女性的1%～5%[2]。RSA常見病因包括遺傳因素、免疫異常、內分泌紊亂、解剖異常等，但仍有部分患者不能確定其病因，即不明原因復發性流產[3]。

腎主生殖，胞胎系于腎。中醫認為，脾腎兩虛，胎元不固是RSA的基本病機。補腎安胎沖劑由壽胎丸化裁而來，具有補腎健脾、清熱安胎功效，兼能益氣養血。前期研究表明，補腎安胎沖劑可顯著降低RSA發生率[4]。血管內皮生長因子（VEGF）與RSA密切相關，其可直接影響母胎界面血管生成，進而導致胚胎丟失[5-6]。課題組基于前期研究[7-10]，觀察補腎安胎沖劑含藥血清對RSA小鼠胎盤滋養細胞功能、VEGF及其受體VEGF-R1、VEGF-R2表達的影響，進一步探索補腎安胎沖劑治療RSA的作用機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性CBA/J小鼠18只，6～7周齡，體質量（19±2）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（京）2019-0008。雄性DBA/2、BALB/c小鼠各5只，6～7周齡，體質量（19±2）g，SPF級雄性SD大鼠20只，6～7周齡，體質量（200±10）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養于安徽中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心。本實驗方案經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（AHUCM-rats-2021078）。

1.2 藥物

補腎安胎沖劑由菟絲子10 g、桑寄生10 g、續斷10 g、熟地黃10 g、黃芪20 g、白術10 g、黨參10 g、黃芩10 g、白芍10 g、苧麻根10 g、墨旱蓮15 g組成，本實驗所用為液體制劑，購于安徽中醫藥大學第一附屬醫院，批號Z20200018000，每瓶120 mL（相當于原藥材71 g）。

1.3 主要試劑與儀器

細胞周期檢測試劑盒（貨號BL114A），合肥Biosharp；原代上皮細胞培養基（貨號PriMed-iCell-001），阿聯酋iCell；胎牛血清（貨號04-001-1ACS），合肥Biosharp；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（貨號RR047A），日本TaKaRa；熒光染料（貨號E096-01B），蘇州Novoprotein；DEPC水（貨號D1007），上海Generay Biotech；VEGF抗體（貨號bs-1313R）、VEGFR1抗體（貨號bsm-52338R），北京Bioss；VEGFR2抗體（貨號ab39256），英國Abcam；GAPDH抗體、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（貨號分別為TA-08、ZB-2305、ZB-2301），北京中杉金橋。

流式細胞儀（型號CytoFLEX），美國BECKMAN公司；熒光定量PCR儀（型號PIKOREAL 96），美國Thermo Scientific公司；電泳儀（型號EPS300）、電泳槽（型號VE-180），上海天能科技有限公司；普通PCR儀（型號K960），杭州晶格科學儀器有限公司；低速迷你離心機（型號LX 300），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；高速臺式冷凍離心機（型號JW-3021HR），安徽嘉文儀器裝備有限公司；微孔板迷你離心機（型號MINI-P25），杭州奧盛儀器有限公司；超微量分光光度計（型號OD1000+），南京五義科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模

參照Clark經典方法[11]，將雌性CBA/J小鼠分別與雄性DBA/2、BALB/c小鼠以2∶1合籠交配，得到RSA模型小鼠與正常妊娠小鼠，合籠后第2日開始每天清晨檢查雌性小鼠陰道，見陰栓者計為妊娠第0日，否則繼續合籠飼養。妊娠15 d后，稱量小鼠體質量，頸椎脫臼處死，取出完整子宮，分離胎盤，置于-80 ℃冰箱保存。

2.2 胎盤滋養細胞分離培養

采用改良密度梯度離心法對原代胎盤滋養細胞進行分離，將得到的單細胞懸液用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

2.3 補腎安胎沖劑含藥血清制備

SD大鼠隨機分為空白血清組和含藥血清組，每組10只，含藥血清組以補腎安胎沖劑11.7 g/（kg·d）灌胃（按體表面積法計算，相當于成人等效劑量3倍），空白血清組予等量蒸餾水灌胃，灌胃體積0.2 mL/10 g，每日2次，連續7 d。末次灌胃2 h后，腹腔注射10%異戊巴比妥鈉（100 mg/kg）麻醉大鼠，無菌條件下腹主動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取上層血清，滅活，除菌，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 含藥血清最佳濃度和作用時間篩選

將RSA小鼠胎盤滋養細胞以1.0×105個/mL接種于96孔培養板，每孔100 μL，將細胞分為對照組和1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%含藥血清組，每組3個復孔，對照組加入20%空白血清，其余各組加入對應濃度的補腎安胎沖劑含藥血清，同時設置空白組調零，置于培養箱分別培養12、24、48、72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL繼續孵育4 h，酶標儀波長450 nm處測量各孔吸光度（OD值），計算細胞增殖活力。細胞增殖活力=（實驗組OD值-空白組OD值）÷（對照組OD值-空白組OD值）。

2.5 細胞分組及給藥

設置正常對照組（正常妊娠小鼠胎盤滋養細胞+20%空白血清）、模型組（RSA小鼠胎盤滋養細胞+20%空白血清）和補腎安胎沖劑組（RSA小鼠胎盤滋養細胞+20%補腎安胎沖劑含藥血清），每組3個復孔，分別加入相應血清培養48 h后進行后續檢測。

2.6 CCK8法檢測細胞增殖活力

調整細胞密度為5×104個/mL，接種至96孔板，每孔100 μL，置于培養箱培養過夜，按“2.5”項下方法處理，采用CCK8法檢測細胞增殖活力。

2.7 流式細胞術檢測細胞周期

將細胞以1.0×106個/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養箱培養過夜，按“2.5”項下方法處理，預冷PBS清洗細胞，胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸洗滌后吸去上清，用預冷乙醇1 mL混勻，4 ℃固定，離心，棄上清，預冷PBS洗2次，離心，沉淀加入0.5 mL染色液（含25 μL碘化丙啶、10 μL RNaseA）重懸，混勻后置于37 ℃避光孵育0.5 h，流式細胞術檢測各周期細胞百分數。

2.8 RT-qPCR檢測

收集胎盤滋養細胞，Trizol法提取總RNA，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，將其作為熒光定量模板，進行PCR，反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot檢測

收集胎盤滋養細胞，加入RIPA裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按1∶4加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱、冷卻至室溫后，上樣至加樣孔，電泳、轉膜后，Western洗滌液洗膜5 min，加5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2、GAPDH一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌，加入二抗（1∶20 000），室溫孵育2 h，洗膜，ECL曝光，凝膠成像系統成像，用Image J軟件對條帶進行分析，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 含藥血清最佳濃度和作用時間篩選結果

當補腎安胎沖劑含藥血清濃度為20%、作用時間48 h時，細胞增殖活力最高，其后隨血清濃度、培養時間增加，細胞增殖活力有下降趨勢，故選擇20%含藥血清培養48 h進行后續實驗。見圖1。

圖1 補腎安胎沖劑含藥血清最佳濃度和最佳作用時間篩選

4.2 補腎安胎沖劑對胎盤滋養細胞增殖活力的影響

與正常對照組比較，模型組胎盤滋養細胞增殖活力明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補腎安胎沖劑組胎盤滋養細胞增殖活力明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組胎盤滋養細胞增殖活力比較（±s）

表2 各組胎盤滋養細胞增殖活力比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常對照組模型組補腎安胎沖劑組n 3 3 3增殖活力1.00±0.00 0.51±0.00*0.74±0.01#

4.3 補腎安胎沖劑對胎盤滋養細胞細胞周期的影響

與正常對照組比較，模型組胎盤滋養細胞S期細胞比例明顯減少，G2/M期細胞比例明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，補腎安胎沖劑組胎盤滋養細胞S期細胞比例明顯增加，G2/M期細胞比例明顯減少（P<0.05）。見表3。

表3 各組胎盤滋養細胞細胞周期比較（±s，%）

表3 各組胎盤滋養細胞細胞周期比較（±s，%）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常對照組模型組補腎安胎沖劑組n 3 3 3 G0/G1期63.25±0.13 42.40±0.61*51.90±0.76#S期8.95±0.13 1.93±0.65*5.36±0.57#G2/M期27.80±0.18 55.67±0.05*42.74±0.26#

4.4 補腎安胎沖劑對胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補腎安胎沖劑組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達明顯升高（P<0.05）。見表4。

表4 各組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達比較（±s）

表4 各組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常對照組模型組補腎安胎沖劑組n 9 9 9 VEGF 1.00±0.07 0.44±0.06*0.59±0.02#VEGF-R1 1.00±0.05 0.48±0.06*0.73±0.04#VEGF-R2 1.00±0.07 0.45±0.05*0.60±0.01#

4.5 補腎安胎沖劑對胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，補腎安胎沖劑組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達明顯升高（P<0.05）。見圖2、圖3。

圖2 各組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白免疫印跡

圖3 各組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表達比較（±s，n=3）

5 討論

RSA是目前生殖醫學領域的研究熱點，中醫藥治療RSA具有明顯優勢[12]。補腎安胎沖劑為安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，以腎主生殖、胞胎系于腎為理論依據，由安胎名方壽胎丸化裁而來。方中君藥菟絲子、黨參先后天并補，菟絲子補腎益精，腎旺自可蔭胎，黨參補氣益血，且能健脾生津；熟地黃補腎填精益髓，加強補腎之功，續斷、桑寄生補肝腎、強筋骨、固沖任，白術、黃芪健脾益氣，以上共為臣藥；白芍養血調經、斂陰柔肝，墨旱蓮涼血止血、補益肝腎，黃芩、苧麻根清熱安胎，以防滋膩太過，為佐使藥。全方共奏補腎健脾、清熱安胎之功。該方治療RSA臨床效果顯著[4]，但其作用靶點與機制尚未完全闡明。

胎盤滋養細胞增殖和凋亡的動態平衡有益于妊娠的維持，病理妊娠的發生多與胎盤滋養細胞異常相關[13]。本研究CCK8檢測發現，補腎安胎沖劑含藥血清能明顯增強RSA小鼠胎盤滋養細胞增殖活力，且在一定范圍內隨著含藥血清濃度增加及給藥時間延長作用增強。流式細胞術檢測結果表明，與正常對照組相比，模型組胎盤滋養細胞S期（DNA合成期）細胞比例顯著下降，細胞多停滯于G2/M期（P<0.05），而補腎安胎沖劑含藥血清干預后，S期細胞比例顯著升高，G2/M期細胞比例顯著下降（P<0.05），提示補腎安胎沖劑可促進胎盤滋養細胞DNA合成，使細胞通過G2/M間期，促進細胞活躍增殖。

研究發現，妊娠的不良結局與母胎界面血管形成異常相關[14]，蛻膜組織VEGF表達水平直接影響早期自然流產的妊娠結局。VEGF具有增加血管通透性，促進血管內皮細胞增殖、遷移等作用，通過與跨膜受體VEGF-R1、VEGF-R2等結合在胎盤及其功能形成過程中發揮至關重要的作用[5]。Bagheri等[15]研究表明，與健康非妊娠及健康妊娠者相比，RSA非妊娠患者體內VEGF-A和VEGF-C表達明顯降低，且與年齡、體質量指數及流產次數呈負相關，并指出VEGF-A、VEGF-C低表達與RSA易感性之間密切關聯，可將其作為URSA患者流產發生的預測標志物。李偉莉等[16]用補腎安胎沖劑治療RSA患者，分別于治療前后檢測患者血清VEGF及可溶性受體-1（sFlt-1）表達，發現可使VEGF表達升高，sFlt-1表達降低，從而促進胎盤血管新生。有研究表明，VEGF表達下降可能對胎盤滋養細胞增殖、凋亡造成不利影響[17]。本研究結果表明，與正常對照組相比，模型組胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達均明顯降低（P<0.05），而補腎安胎沖劑含藥血清干預后，胎盤滋養細胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達均明顯升高（P<0.05），表明補腎安胎沖劑可上調VEGF及其受體VEGF-R1、VEGF-R2表達，介導母胎界面血管新生，提高妊娠成功率。

綜上所述，補腎安胎沖劑含藥血清能明顯增強RSA小鼠胎盤滋養細胞增殖活力，同時顯著上調VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA及蛋白表達，促進胎盤滋養細胞血管新生。