祛風宣痹方對哮喘大鼠氣道炎癥及MEK/ERK信號通路的影響

王博寒，楊穎，史鎖芳，劉麗，湯玲玲，孫憲泓

南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029

支氣管哮喘是由多種細胞、細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，臨床主要表現為發作性氣喘、胸悶、呼吸不暢、咳嗽，常在夜間或凌晨加重。雖然其發病機制尚不十分明確，但普遍認為與氣道炎癥[1]、氣道高反應性[2]及氣道重塑[3]等因素相關。持續存在的氣道慢性炎癥是哮喘反復發作、遷延難愈的重要原因，有效控制氣道炎癥是其治療的重點。祛風宣痹方由史鎖芳教授以祛風宣痹、化痰通陽、肅肺平喘為法創制而成，為南京中醫藥大學附屬醫院院內制劑，能有效緩解哮喘發作且遠期療效顯著[4]。前期研究表明，祛風宣痹方能抑制哮喘模型肺組織核因子-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶表達，調節Th1/Th2平衡，減少嗜酸性粒細胞浸潤[5-7]。本研究以卵清蛋白（OVA）誘導大鼠哮喘模型和脂多糖（LPS）誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型為研究對象，觀察祛風宣痹方對氣道炎癥相關因子及MEK/ERK信號通路的影響，探究其改善氣道炎癥的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物與細胞

清潔級雄性SD大鼠18只，體質量180～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（蘇）2017-0069，飼養于南京中醫藥大學附屬醫院動物實驗室。小鼠巨噬細胞RAW264.7，購于中國科學院細胞資源中心。

1.2 藥物及制備

祛風宣痹方（射干10 g，炙麻黃6 g，制僵蠶10 g，瓜蔞10 g，薤白10 g，海風藤20 g，白芍15 g，炙甘草5 g，葶藶子10 g，蛤殼20 g，桃仁10 g，苦杏仁10 g，地龍10 g，黃芩10 g，蛇床子10 g），飲片購于南京中醫藥大學附屬醫院。所有飲片混合，第1次加1 000 mL水煎煮45 min，第2次加500 mL水煎煮45 min，收集2次煎煮液，過濾，加熱濃縮至原藥材濃度為1.66 g/mL煎劑，4 ℃保存備用。另由上海中醫藥大學中藥現代制劑技術教育部工程研究中心制作祛風宣痹方凍干粉，每克凍干粉相當于原藥材5.32 g，使用時以DMEM培養基稀釋至相應濃度用于細胞實驗。

1.3 主要試劑與儀器

MEK通路抑制劑U0126，上海Selleck公司，批號S110206；OVA，美國Sigma公司，批號SLCD9424；LPS，美國Sigma公司，批號SLCD9424；胎牛血清，以色列Biological Industries公司，批號2128196；細胞外調節蛋白激酶（ERK）1/2抗體，美國CST公司，批號4695；p-ERK1/2抗體，美國CST公司，批號4370；羊抗兔IgG，美國CST公司，批號7074；MEK1/2抗體，美國Affinity公司，批號AF6385；p-MEK1/2抗體，美國Affinity公司，批號AF8035；β-actin抗體，美國Affinity公司，批號T0022；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物，批號P0012；一抗稀釋液，上海碧云天生物，批號P0023A；ECL發光液，安徽Biosharp公司，批號70100030。

Mini Trans-Blot Cell轉印槽、Mini PROTEAN 3Cell型垂直電泳槽、CHEMIDOC XRS+型伯樂凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；Fresco21型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ELX-800型酶標儀，美國BioTek公司；SIM-F140AY65-PC制冰機，日本Panasonic公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及干預

18只大鼠隨機分為對照組、哮喘組和祛風宣痹方組，每組6只。哮喘組和祛風宣痹方組造模第1日用10% OVA和氫氧化鋁混合物1 mL腹腔注射致敏，造模第7日再致敏1次；造模第15日，使用超聲霧化器以400 mm Hg（1mm Hg=0.133 kPa）恒壓噴入1% OVA溶液激發哮喘，每次30 min，隔日1次，共7次。對照組用生理鹽水代替OVA。大鼠在霧化前呼吸平穩，霧化過程中出現撓鼻、咳嗽、煩躁、呼吸加快等表現，激發后2 min內咳嗽次數增多表明造模成功。祛風宣痹方組第15日開始于霧化前1 h予祛風宣痹方煎劑20.7 g/（kg·d）灌胃，對照組和哮喘組予等量生理鹽水灌胃，每日2次，連續14 d。

2.2 標本采集

干預結束后，稱量大鼠體質量，麻醉，將大鼠固定，腹主動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清，-20 ℃保存備用。分離氣管，剪開胸腔，結扎左側支氣管，用生理鹽水灌洗右肺肺泡，每次注入生理鹽水約0.6 mL，緩慢注入后緩慢回抽，重復灌洗3次，收集肺泡灌洗液，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，上清液于-20 ℃保存備用。留取部分左肺組織進行HE染色，剩余肺組織液氮中快速冷凍，用于Western blot檢測。

2.3 細胞培養及干預

RAW264.7細胞用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的DMEM完全培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞融合達70%～80%時進行實驗。

將RAW264.7細胞以1×104個/孔接種于96孔板，將細胞分為對照組和不同濃度（5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）祛風宣痹方組，每組6個復孔，分別處理24 h，加入5 mg/mL MTT溶液15 μL，培養箱孵育4 h，棄去培養液，每孔加入DMSO 150 μL，避光低速振蕩10 min，酶標儀波長490 nm檢測光密度（OD值），計算細胞活力[（實驗組OD值-對照組OD值）÷對照組OD值×100%]，篩選祛風宣痹方最佳作用濃度。

將RAW264.7細胞以3×105個/孔接種于6孔板，將細胞分為對照組、LPS組（1 μg/mL LPS）、祛風宣痹方組（1 μg/mL LPS+40 μg/mL祛風宣痹方）和U0126組（1 μg/mL LPS+10 μmol/L U0126），每組3個復孔，分別處理24 h，收集細胞和培養液進行后續檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 肺組織HE染色

肺組織經甲醛固定、石蠟包埋后切片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色5 min，清水沖洗，1%鹽酸酒精脫色2～3 s，清水返藍5 min，伊紅染色3 min，清水沖洗，依次放入70%、80%、90%酒精中2～3 s，無水酒精浸泡5 min，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中浸泡5 min，自然風干，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.4.2 ELISA檢測

取外周血和肺泡灌洗液，參照試劑盒說明書步驟，酶標儀波長450 nm測量OD值，根據回歸方程計算血清IgE、白細胞介素（IL）-6及肺泡灌洗液IL-6含量。收集細胞培養液，參照試劑盒說明書檢測IL-6含量。

2.4.3 Western blot檢測

加入裂解液提取肺組織、RAW264.7細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，加入6×上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min使蛋白變性；制備10%分離膠和5%濃縮膠，取20 μg蛋白進行電泳（80 V、30 min，120 V、90 min），250 mA轉膜90 min，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入MEK1/2一抗（1∶1 000）、p-MEK1/2一抗（1∶1 000）、ERK1/2一抗（1∶1 000）、p-ERK1/2一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌4次，加入羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，加ECL發光液顯影。采用Image Lab軟件對條帶進行灰度分析。

3 統計學方法

4 結果

4.1 祛風宣痹方對模型大鼠肺組織病理形態的影響

對照組大鼠氣道黏膜上皮及肺泡結構相對完整，未見明顯炎癥反應。與對照組比較，哮喘組大鼠氣道壁增厚，支氣管周圍炎性細胞增多；與哮喘組比較，祛風宣痹方組大鼠氣道黏膜水腫和炎癥細胞浸潤有所減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態（HE染色，×40）

4.2 祛風宣痹方對模型大鼠血清和肺泡灌洗液IgE、白細胞介素-6含量的影響

與對照組比較，哮喘組大鼠血清IgE、IL-6和肺泡灌洗液IL-6含量顯著增加（P<0.01）；與哮喘組比較，祛風宣痹方組大鼠血清IgE、IL-6和肺泡灌洗液IL-6含量顯著減少（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清和肺泡灌洗液IgE、IL-6含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清和肺泡灌洗液IgE、IL-6含量比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與哮喘組比較，##P<0.01

組別對照組哮喘組祛風宣痹方組只數6 6 6血清IgE/（μg/mL）10.96±1.97 17.78±2.92**14.46±1.88##IL-6/（pg/mL）血清27.73±4.94 43.98±2.18**27.70±4.28##肺泡灌洗液28.84±3.02 45.17±5.00**17.86±1.67##

4.3 祛風宣痹方對模型大鼠肺組織MEK/ERK通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，哮喘組大鼠肺組織p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與哮喘組比較，祛風宣痹方組大鼠肺組織p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠肺組織MEK/ERK通路相關蛋白免疫印跡

表2 各組大鼠肺組織p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與哮喘組比較，#P<0.05

組別對照組哮喘組祛風宣痹方組只數6 6 6 p-MEK1/2 1.00±0.36 2.97±0.22*1.91±0.39#p-ERK1/2 1.00±0.39 1.88±0.26*0.97±0.36#

4.4 祛風宣痹方對RAW264.7細胞活力的影響

不同濃度祛風宣痹方（0～320 μg/mL）作用RAW264.7細胞24 h后，與對照組比較，5～40 μg/mL祛風宣痹方對細胞活力無顯著影響（P>0.05），80～320 μg/mL祛風宣痹方能顯著降低RAW264.7細胞活力（P<0.05），因此選擇40 μg/mL祛風宣痹方用于后續實驗。見表3。

表3 不同濃度祛風宣痹方對RAW264.7細胞活力的影響（±s，%）

表3 不同濃度祛風宣痹方對RAW264.7細胞活力的影響（±s，%）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別對照組祛風宣痹方組濃度/（μg/mL）5 10 20 40 80 160 320 n6 6 6 6 6 6 6 6細胞活力100.00±3.42 93.64±2.72 95.31±6.82 94.27±2.48 90.83±4.50 85.68±1.56*81.08±6.13*80.65±5.70*

4.5 祛風宣痹方對細胞培養液白細胞介素-6含量的影響

與對照組比較，LPS組細胞培養液IL-6含量顯著增加（P<0.01)；與LPS組比較，祛風宣痹方組和U0126組細胞培養液IL-6含量顯著減少（P<0.05）。見表4。

表4 各組RAW264.7細胞培養液IL-6含量比較（±s，pg/mL）

表4 各組RAW264.7細胞培養液IL-6含量比較（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05

組別對照組LPS組祛風宣痹方組U0126組n 3 3 3 3 IL-6 79.65± 29.76 832.62± 80.72**601.23±137.96#496.61± 34.97#

4.6 祛風宣痹方對RAW 264.7細胞MEK/ERK信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS組細胞p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與LPS組比較，祛風宣痹方組和U0126組細胞p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達顯著降低（P<0.01）。見圖3、表5。

圖3 各組RAW264.7細胞MEK/ERK信號通路相關蛋白免疫印跡

表5 各組RAW264.7細胞p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較（±s）

表5 各組RAW264.7細胞p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01

組別對照組LPS組祛風宣痹方組U0126組n 3 3 3 3 p-MEK1/2 1.00±0.13 1.94±0.35**1.39±0.12##0.85±0.15##p-ERK1/2 1.00±0.08 1.79±0.10**1.36±0.03##0.74±0.16##

5 討論

目前哮喘全球患病人數約4億，我國哮喘患者已超過4 500萬人，且每年因哮喘死亡者高達20萬人[8]。哮喘發作與中醫學“風痰”密切相關。課題組前期研究發現，風痰阻肺是哮喘患者最常見的中醫證型之一，其關鍵病機為風痰阻肺、肺失宣肅、胸陽痹阻。祛風宣痹方中炙麻黃祛風平喘，薤白通陽宣痹，制僵蠶熄風止痙，共為君藥；射干祛痰利咽，瓜蔞泄濁寬胸，地龍祛風通絡，葶藶子瀉肺化痰，苦杏仁肅肺降氣，白芍、炙甘草柔肝緩急、止痙平喘，共為臣藥；海風藤祛風除濕，黃芩清肺熱，桃仁化瘀血，蛤殼軟堅化痰，蛇床子祛風燥濕、溫腎助陽。諸藥合用，共奏祛風宣痹、化痰通陽、肅肺平喘之效。

IgE是一種免疫球蛋白，其在哮喘發病過程中的多效性作用是通過激活免疫炎癥細胞和氣道結構細胞表達的特異性IgE受體介導的。此外，相關臨床研究發現，哮喘患者病情與IgE水平呈正相關，抑制IgE水平有益于哮喘治療[9]。IL-6作為重要的促炎因子，能夠促進炎癥急性反應期蛋白合成，是誘導哮喘氣道炎癥發生的關鍵因素之一[10]。此外，有研究表明，哮喘患者IL-6水平可以反映肺功能損傷程度[11]。在前期研究基礎上，本研究體內實驗以OVA腹腔注射致敏再霧化激發的方法制備哮喘大鼠模型，體外實驗以LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應，均予祛風宣痹方干預，從肺組織病理改變，血清、肺泡灌洗液及細胞培養液IgE、IL-6水平考察祛風宣痹方的干預效果。結果顯示，模型大鼠肺組織炎癥細胞浸潤、水腫明顯，血清和肺泡灌洗液IgE、IL-6含量增加，而祛風宣痹方能抑制模型大鼠病理改變，改善氣道炎癥。此外，LPS誘導后，RAW264.7細胞培養液IL-6含量增加，祛風宣痹方能逆轉這一變化，表明祛風宣痹方可以抑制RAW264.7細胞炎癥反應。

MEK和ERK是絲裂原活化蛋白激酶三級酶促級聯反應的重要組成部分。上游激活蛋白RAS與RAF蛋白結合后，形成具有激活RAF激酶活性的二聚體，使RAF激酶磷酸化，進一步激活MEK激酶，磷酸化ERK激酶，這一過程可以促進炎癥因子的生成和釋放，使機體產生炎癥反應[12-13]。研究表明，MEK/ERK信號通路能調節IL-6表達，抑制ERK激活不僅能下調IL-6表達，還能阻斷IL-6受體表達[14-15]。本實驗中，模型大鼠肺組織和LPS誘導的RAW264.7細胞p-MEK1/2和p-ERK1/2蛋白表達均顯著升高，表明MEK/ERK信號通路激活與哮喘發生密切相關。而祛風宣痹方可減少模型大鼠血清、肺泡灌洗液及細胞培養液IL-6分泌，抑制MEK1/2、ERK1/2蛋白磷酸化，其作用與MEK通路抑制劑U0126相當，提示祛風宣痹方能通過MEK/ERK信號通路發揮改善氣道炎癥作用。

綜上所述，祛風宣痹方能通過抑制MEK/ERK信號通路改善氣道炎癥，從而治療哮喘。今后本課題組將繼續深入研究祛風宣痹方改善氣道炎癥的其他作用機制，為其臨床應用提供實驗依據。