益腎疏肝湯對卵巢儲備功能減退模型大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響

肖瀟 ，劉艷霞 ，危一飛 ，邢玉 ，劉君 ，滕秀香

1.北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，北京 100078； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078； 4.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102

卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢中卵母細胞數(shù)目減少或質(zhì)量下降，引起女性生殖功能減退[1]，同時伴有抗米勒管激素（AMH）水平降低、竇卵泡數(shù)目減少、促卵泡素（FSH）水平升高[2]。DOR發(fā)病率約10%～35%[3]，臨床常表現(xiàn)為生育能力降低、月經(jīng)紊亂、性激素缺乏或波動相關(guān)癥狀[4-5]。DOR發(fā)病機制尚不完全明確，目前普遍認為，多種因素引起的卵巢顆粒細胞過度凋亡，卵泡閉鎖加速，卵母細胞數(shù)量及質(zhì)量下降是DOR重要發(fā)病機制。國內(nèi)外對于DOR尚無確切有效的治療方法，對有生育需求的患者，建議積極試孕或輔助生殖技術(shù)[6-7]。臨床常采用性激素治療模擬女性正常生理周期，提高患者的生活質(zhì)量，改善其臨床癥狀，但禁忌證及慎用情況較多，對卵巢儲備及生育力改善效果不明顯[8]。

中醫(yī)藥治療DOR具有一定優(yōu)勢，可以多系統(tǒng)、多靶點調(diào)控性腺軸，改善激素水平，緩解臨床癥狀，保護卵巢功能[9-10]。滕秀香教授傳承國醫(yī)大師柴嵩巖學術(shù)思想，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，提出腎虛肝郁證為DOR的主要病機[11]，應(yīng)用補腎疏肝法治療。益腎疏肝湯為首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院治療DOR的協(xié)定處方。前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎疏肝湯治療腎虛肝郁型DOR，不僅能改善患者臨床癥狀，還能改善卵巢儲備功能，調(diào)節(jié)性激素水平[12]。因此，為進一步探討益腎疏肝湯治療DOR的作用機制，本研究采用雷公藤多苷制備DOR大鼠模型，觀察大鼠動情周期、性腺指數(shù)、卵巢組織形態(tài)變化，并檢測血清性激素水平、卵巢顆粒細胞凋亡及卵巢組織凋亡蛋白表達，探討其治療DOR的分子機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雌性SD大鼠32只，12周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于中國食品藥品檢定研究院，動物許可證號SCXK（京）2017-005。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院實驗動物中心標準動物房，自由攝食飲水。本實驗由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會審查批準（2022-05-08）。

1.2 藥物及制備

益腎疏肝湯（女貞子15 g，熟地黃10 g，墨旱蓮15 g，北沙參20 g，石斛10 g，續(xù)斷15 g，桑寄生15 g，菟絲子15 g，酒白芍10 g，月季花6 g，柴胡5 g，白梅花10 g，丹參10 g，桃仁10 g，瞿麥6 g，葛根6 g，甘草6 g），飲片購于首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院。上述飲片按常規(guī)方法水煎、濃縮，配制成濃度分別為1.92、3.83 g/mL益腎疏肝湯藥液。雷公藤多苷片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，10 mg/片，批號210102，用蒸餾水配成濃度為5 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

FSH檢測試劑盒（貨號H101-1-1），南京建成生物工程研究所；雌二醇（E2）檢測試劑盒（貨號CEA461Ge）、AMH檢測試劑盒（貨號CEA228Ra），武漢云克隆科技股份有限公司；HE染色試劑盒（貨號G1120），北京索萊寶科技有限公司；一步法TUNEL細胞凋亡試劑盒（貨號C1089），碧云天生物技術(shù)有限公司；Bcl-2抗體（貨號Sc-492），美國Santa Cruz公司；Bax抗體（貨號50599-2-IG），美國Proteintech公司；Caspase-3抗體（貨號ab4051），英國Abcam；GAPDH抗體（貨號AB-P-R 001），杭州賢至生物科技有限公司。共聚焦顯微鏡（型號LSM 780，德國Zeiss），臺式玻片掃描機（型號Aperio CS2，德國Leica），Western blot電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），高速冷凍離心機（型號FRESCO 21，美國 Thermo Fisher公司），水平脫色搖床（型號WD-9405C，北京六一儀器）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，采用隨機數(shù)字表法分成空白組8只、造模組24只，空白組不予處理，造模組予雷公藤多苷片混懸液50 mg/kg灌胃14 d，每日1次[13-14]。造模結(jié)束后次日觀察大鼠陰道涂片，出現(xiàn)某一周期時間延長，周期紊亂表現(xiàn)，表明造模成功。將24只成模大鼠再隨機分為模型組和中藥低、高劑量組，每組8只，造模成功后次日開始給藥，根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量計算，中藥低劑量組予益腎疏肝湯16.38 g/kg（相當于臨床等效劑量）灌胃，中藥高劑量組予益腎疏肝湯32.76 g/kg（相當于臨床等效劑量2倍）灌胃，空白組和模型組予生理鹽水3 mL灌胃，每日1次，連續(xù)15 d。

2.2 取材

給藥結(jié)束后，0.3%戊巴比妥鈉10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血2 mL，室溫靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｎi椎脫臼處死大鼠，無菌條件下取出子宮、卵巢并稱重，一側(cè)卵巢置于10%中性甲醛溶液中浸泡，另一側(cè)卵巢放于-80 ℃冰箱備用。

2.3 指標檢測

2.3.1 動情周期

每日上午9:00用細棉簽蘸取生理鹽水，于大鼠陰道內(nèi)輕輕旋轉(zhuǎn)2圈，行陰道涂片，涂片風干后30 min，置于蘇木素染料中浸泡3 min，流水沖洗5 s，1%鹽酸酒精溶液分化10 s，流水輕輕沖洗5 s，放入伊紅染料中浸泡1 min，水洗5 s。顯微鏡下觀察陰道脫落細胞的種類和形態(tài)，判斷大鼠動情周期。分別記錄大鼠造模期和給藥期動情次數(shù)。

2.3.2 性腺指數(shù)

根據(jù)大鼠子宮、卵巢濕重及末次稱量體質(zhì)量計算卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)。卵巢指數(shù)=雙側(cè)卵巢濕重÷體質(zhì)量；子宮指數(shù)=子宮濕重÷體質(zhì)量。

2.3.3 血清性激素水平

采用ELISA檢測血清AMH、FSH、E2含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.3.4 卵巢形態(tài)觀察

卵巢用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋，制成5 μm切片，HE染色后，顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)、各級卵泡數(shù)目，采用ImageScope軟件記錄。

2.3.5 卵巢顆粒細胞凋亡率

各組隨機選取3只大鼠卵巢組織蠟塊，切片（厚度5 μm），TUNEL法檢測卵巢顆粒細胞凋亡情況，嚴格按試劑盒說明書操作。以細胞核出現(xiàn)紅色顆粒為陽性細胞，每張切片隨機選取3個視野，采用Image J 1.8.0軟件計算顆粒細胞凋亡率（陽性細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%）。

2.3.6 Western blot檢測

加入RIPA裂解液提取卵巢組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白濃度調(diào)整為2 μg/μL，上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Bax、Caspase-3、Bcl-2一抗（均為1∶1 000），4 ℃水平搖床孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，加二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜10 min×3次，化學發(fā)光，顯影成像，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Image J 1.8.0軟件對條帶進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

實驗過程中各組大鼠均無死亡。空白組大鼠狀態(tài)良好，被毛光滑，飲食正常；模型組大鼠精神狀態(tài)差，被毛稀松，飲食減少；中藥低、高劑量組大鼠上述表現(xiàn)較模型組有所改善，精神狀態(tài)轉(zhuǎn)佳，被毛逐漸光滑，飲食增加。

4.1 益腎疏肝湯對模型大鼠動情周期的影響

造模結(jié)束后，與空白組比較，造模大鼠動情次數(shù)明顯減少（P<0.01）。給藥結(jié)束后，與空白組比較，模型組大鼠動情次數(shù)明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠動情次數(shù)明顯增加（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動情次數(shù)比較（±s，次）

表1 各組大鼠動情次數(shù)比較（±s，次）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組只數(shù)8 8 8 8造模期2.87±0.33 1.38±0.48**1.50±0.50**1.38±0.69**給藥期2.87±0.33 1.50±0.50**2.13±0.50#2.25±0.71#

4.2 益腎疏肝湯對模型大鼠性腺指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠性腺指數(shù)比較（±s，mg/g）

表2 各組大鼠性腺指數(shù)比較（±s，mg/g）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組只數(shù)8 8 8 8卵巢指數(shù)0.59±0.05 0.52±0.08**0.57±0.01#0.58±0.01#子宮指數(shù)2.23±0.15 1.93±0.27**2.26±0.32#2.32±0.30#

4.3 益腎疏肝湯對模型大鼠血清性激素含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清AMH、E2含量明顯減少（P<0.01），F(xiàn)SH含量明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠血清AMH、E2含量明顯增加（P<0.01），F(xiàn)SH含量明顯減少（P<0.01）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組大鼠血清AMH、E2含量明顯增加（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清AMH、FSH、E2含量比較（±s）

表3 各組大鼠血清AMH、FSH、E2含量比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與中藥低劑量組比較，△P<0.05

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組只數(shù)8 8 8 8 AMH/（pg/mL）0.43±0.02 0.31±0.02**0.36±0.01##0.38±0.01##△FSH/（mIU/mL）0.35±0.04 0.60±0.15**0.42±0.01##0.40±0.00##E2/（pg/mL）1.05±0.05 0.82±0.04**0.93±0.02##0.97±0.02##△

4.4 益腎疏肝湯對模型大鼠卵巢組織形態(tài)的影響

空白組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)清晰，各級卵泡發(fā)育良好，成熟卵泡中顆粒細胞層次多、卵泡液多，可見完整的卵母細胞，卵巢間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤及纖維化；模型組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)明顯紊亂，各級卵泡數(shù)目均明顯減少，閉鎖卵泡數(shù)目增多，未見成熟卵泡，卵泡中顆粒細胞層次減少、排列紊亂疏松，卵巢間質(zhì)可見大量炎癥細胞浸潤及纖維化；中藥低劑量組大鼠卵巢組織病理形態(tài)較模型組有所改善，各級卵泡及成熟卵泡數(shù)目增加、卵泡液含量增多，仍可見部分閉鎖卵泡，卵巢間質(zhì)可見少量炎癥細胞浸潤及纖維化；中藥高劑量組大鼠卵巢組織病理形態(tài)明顯改善，僅見少量閉鎖卵泡，各級卵泡及成熟卵泡數(shù)目明顯增加，顆粒細胞層次增多、卵泡液含量增多。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)（HE染色，×100）

4.5 益腎疏肝湯對模型大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率明顯降低（P<0.05），中藥高劑量組明顯優(yōu)于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖2、表4。

表4 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（±s，%）

表4 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與中藥低劑量組比較，△△P<0.01

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組只數(shù)3 3 3 3凋亡率4.0± 3.1 74.6±11.3**41.2±12.2#11.3± 8.9#△△

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

4.6 益腎疏肝湯對模型大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織Bax、Caspase-3蛋白表達明顯升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠卵巢組織Bax、Caspase-3蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01），Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯升高（P<0.05，P<0.01）。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組中藥低劑量組中藥高劑量組只數(shù)6 6 6 6 Bcl-2 0.93±0.20 0.60±0.08**0.82±0.15#0.85±0.15#Bax 0.53±0.17 1.12±0.31**0.82±0.25#0.82±0.24#Bcl-2/Bax 1.85±0.44 0.56±0.13**1.07±0.26##1.09±0.17##Caspase-3 0.59±0.09 1.00±0.17**0.77±0.14##0.70±0.10##

5 討論

DOR近年來有年輕化的趨勢。隨著生育年齡逐漸后移，卵巢功能及生育能力減退嚴重影響女性的生殖及身心健康。因此，早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)對保護女性卵巢儲備功能及生育能力有重要意義。臨床常用的激素替代療法治療DOR可有效恢復(fù)月經(jīng)周期、調(diào)整激素代謝水平、改善臨床癥狀，但很難恢復(fù)患者的卵巢儲備功能。

腎虛肝郁為DOR的常見證型[15]，補腎填沖、疏肝養(yǎng)血為其常用治法。補腎疏肝類中藥治療DOR在改善激素水平、提高AMH及竇卵泡數(shù)目方面與西藥相當，但不良反應(yīng)少[16]。益腎疏肝湯以女貞子、熟地黃相須為君藥，入肝、腎二經(jīng)，滋陰補血同時填充沖脈血海；北沙參、墨旱蓮、石斛、續(xù)斷、菟絲子、桑寄生為臣藥，補益肝腎、滋陰清熱；酒白芍、月季花、柴胡、白梅花養(yǎng)血柔肝、疏肝解郁，丹參、桃仁活血調(diào)經(jīng)，瞿麥、葛根退熱生津，以上共為佐藥；甘草為使，調(diào)和諸藥。該方補腎疏肝同時養(yǎng)血柔肝、退熱生津以護陰液，滋陰而不壅滯，疏肝而不辛燥，達改善卵巢功能之效。研究表明，方中女貞子、墨旱蓮、續(xù)斷、熟地黃、菟絲子等具有調(diào)節(jié)血清性激素水平、刺激卵泡生長、增加子宮腺體指數(shù)、保護卵巢功能作用[17-20]。顆粒細胞過度凋亡會加速卵巢卵泡閉鎖，引起DOR[21-22]，鑒于此，我們推測益腎疏肝湯可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子表達→抑制卵巢顆粒細胞凋亡→減少卵泡閉鎖→提高卵巢儲備功能→治療DOR，并通過本研究加以驗證。

本研究采用雷公藤多苷灌胃制備DOR大鼠模型，結(jié)果顯示，造模后大鼠精神狀態(tài)差，被毛逐漸稀松，飲食量減少，并出現(xiàn)動情周期紊亂，性腺指數(shù)顯著下降。經(jīng)益腎疏肝湯干預(yù)后，大鼠精神狀態(tài)轉(zhuǎn)佳，被毛逐漸光滑，飲食量增加，動情周期縮短并趨于正常，性腺指數(shù)提高。血清性激素水平是直接反映卵巢功能的重要指標，其中FSH水平升高及AMH水平下降為臨床診斷DOR的主要指標，E2水平為DOR診斷的重要參考。模型組大鼠血清AMH、E2水平下降，F(xiàn)SH水平升高；中藥低、高劑量組大鼠血清AMH、E2水平顯著升高，F(xiàn)SH水平顯著下降，提示益腎疏肝湯能有效改善DOR大鼠血清性激素水平，對下丘腦-垂體-性腺軸具有一定的調(diào)控作用。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織各級卵泡數(shù)目明顯減少，有大量卵泡閉鎖；與模型組相比，益腎疏肝湯可有效恢復(fù)模型大鼠卵巢結(jié)構(gòu)，促進各級卵泡發(fā)育，減少卵泡異常閉鎖，減少炎癥細胞浸潤及纖維化，且中藥高劑量組效果更明顯。

目前認為，卵巢顆粒細胞過度凋亡是引起卵巢功能下降的主要原因。卵泡顆粒細胞處于凋亡狀態(tài)和層數(shù)減少也作為DOR造模成功的重要依據(jù)[23]，強調(diào)了顆粒細胞凋亡是DOR重要的發(fā)病機制。Bcl-2蛋白家族介導(dǎo)的線粒體內(nèi)源凋亡通路在卵巢顆粒細胞凋亡過程中占主導(dǎo)地位，Bcl-2/Bax比值被稱為細胞的“凋亡開關(guān)”，影響卵泡發(fā)育或閉鎖。Caspase是細胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，多條凋亡信號通路均需Caspase-3介導(dǎo)。Bcl-2/Bax比值降低后引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)卵巢顆粒細胞凋亡[24]，而糾正相關(guān)凋亡蛋白表達可抑制顆粒細胞凋亡，一定程度恢復(fù)卵巢功能[22]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率明顯升高，卵巢組織Bcl-2蛋白表達降低，Bax、Caspase-3蛋白表達升高，同時Bcl-2/Bax比值降低；經(jīng)益腎疏肝湯干預(yù)后，卵巢顆粒細胞凋亡率明顯降低，卵巢組織Bcl-2蛋白表達升高，Bax、Caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2/Bax比值升高，提示益腎疏肝湯可能通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達，逆轉(zhuǎn)卵巢顆粒細胞凋亡情況。

綜上，益腎疏肝湯可恢復(fù)DOR模型大鼠動情周期，提高性腺指數(shù)，減少卵泡閉鎖，調(diào)節(jié)血清性激素水平，從而改善DOR大鼠病理狀態(tài)，提高卵巢儲備功能，其機制與抑制卵巢顆粒細胞凋亡有關(guān)。本研究存在一定局限性，包括樣本量偏小、未使用在定位方面更具優(yōu)勢的免疫組化方法評估Bcl-2、Bax等蛋白表達，未使用RT-PCR檢測基因變化，未在信號通路層面探究益腎疏肝湯治療DOR的機制等，今后將進一步完善。

備注：肖瀟，北京中醫(yī)藥大學以同等學力申請博士學位在職人員。