陽和湯對三陰性乳腺癌細胞凋亡的影響及機制研究

任翠翠 ，李俊峰 ，呂佳佳 ，葉凱 ，劉子源 ，黃芊 ，竇建衛

1.西安市第一醫院，陜西 西安 710002； 2.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；3.邛崍天銀制藥有限公司，四川 邛崍 611530； 4.西安交通大學醫學部，陜西 西安 710061；5.西安市中醫醫院，陜西 西安 710021

世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的全球癌癥負擔數據顯示，2020年全球新增癌癥中，乳腺癌（11.7%）首次超過肺癌（11.4%）成為全球新確診人數最多的癌癥[1]。目前乳腺癌主要以手術為主，并配合放療、化療、免疫及內分泌治療等[2-3]。中醫治療乳腺癌積累了豐富經驗，《外科癥治全生集》記載陽和湯用于治療乳巖，乳巖歸于陰疽，屬陰證、寒證，病機主要為陰寒凝結，氣血凝滯，故提出以陽和湯加土貝母的方法治療乳腺癌[4]。近年來，關于陽和湯治療乳腺癌的臨床及基礎研究也屢見報道[5-7]，然其機制不甚明了。

研究發現，與細胞凋亡有關的STAT1/p53信號通路是乳腺癌發生發展的關鍵環節[8]。前期研究發現，陽和湯含藥血清可顯著抑制三陰性乳腺癌細胞BT549增殖及遷移[9]。在此基礎上，本研究以STAT1/p53信號通路為切入點，觀察陽和湯含藥血清對BT549細胞形態、凋亡和周期的影響，探討陽和湯治療三陰性乳腺癌的具體作用機制，為其臨床應用和后續研究提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

SPF級雌性SD大鼠40只，體質量180～220 g，購于西安交通大學醫學部實驗動物中心。飼養于西安交通大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，實驗過程遵守西安交通大學醫學部生物醫學倫理委員會指導原則與要求。人三陰性乳腺癌細胞BT549，購自上海晶都生物技術有限公司。

1.2 藥物及制備

陽和湯（熟地黃30 g，肉桂3 g，麻黃2 g，鹿角膠9 g，芥子6 g，姜炭2 g，甘草3 g，土貝母15 g），飲片購自北京同仁堂西安門店，經西安交通大學藥學院竇建衛副教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》標準。鹿角膠先加水1 000 mL煎煮1 h，再加入熟地黃、肉桂、芥子、姜炭、甘草、土貝母繼續煎煮30 min，后下麻黃，煎煮10 min，取濾液，藥渣加水600 mL再煎煮20 min，合并2次藥液，濃縮至原藥材濃度1.4 g/mL，4 ℃保存備用。5-氟尿嘧啶注射液，天津金耀，批號12020959，0.25 g/支。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養基（美國HyClone公司，貨號SH30809.01），胎牛血清（美國Gibco公司，批號M3851），胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗（美國HyClone公司，批號分別為SH3004201、SV30010），信號傳導和轉錄激活因子（STAT）1抗體（美國CST公司，貨號#9176），STAT3抗體（武漢三鷹生物，貨號#10253），p53抗體（武漢三鷹生物，貨號#60283），Bax抗體（美國CST公司，貨號#89477），DAPI染色液（江蘇凱基生物，貨號KGA215），細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒（福州飛凈生物，批號分別為PH0539、PH0530）。

倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號BX53），電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司，型號JY300C），細胞恒溫恒壓培養箱（美國Thermo Scientific公司，型號TC 2323），全自動酶標分析儀（美國Thermo Scientific公司，型號HT2型），低溫冰箱（青島海爾公司，型號BCD-458WDVMU1），超低溫冰箱（青島海爾，型號DW-40L278），離心機（德國Heraeus公司，型號Biofugeprimo R），流式細胞儀（美國BD公司，型號FACSCalibur）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

根據體質量將大鼠隨機分為空白對照組、陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組，每組8只。陽和湯低、中、高劑量組按4.5、9、18 g/kg灌胃（相當于臨床成人劑量的5、10、20倍），陽性藥組尾靜脈注射5-氟尿嘧啶注射液（0.125 g/5 mL）15 mg/kg，空白對照組和陽性藥組予蒸餾水灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每日2次，連續7 d。末次給藥后1 h，腹主動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，分裝，-80 ℃凍存備用。

2.2 細胞培養及分組

將胎牛血清與RPMI-1640培養基以1∶9比例混合，再按總體積的1%加入雙抗搖勻，配制成完全培養基。BT549細胞復蘇或傳代后，每培養瓶（25 cm2）加完全培養基4 mL，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，取對數生長期細胞用于實驗。將細胞分為空白對照組、陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組，將大鼠血清分別加空白培養基稀釋，配制成10%含藥血清，用于干預細胞。

2.3 DAPI染色

取對數生長期細胞，以1×106個/孔接種至6孔板，待細胞貼壁后棄去原培養基，加入相應含藥血清培養基培養48 h，棄去培養基，PBS洗滌細胞，每孔加入DAPI染液100 μL，避光孵育10～15 min，棄去染色液，PBS漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞接種至6孔板中，每孔約1×106個，培養12 h后，棄去原培養基，血清饑餓法繼續培養24 h，加入相應含藥血清培養基培養48 h，棄去舊培養基，PBS洗滌，胰酶消化細胞1 min，將細胞轉移至10 mL離心管，PBS洗滌2次，1 200 r/min離心4.5 min，收集細胞，加入Binding Buffer 450 μL、Annexin V-FITC溶液5 μL、PI溶液10 μL充分混勻，室溫避光反應10～15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期

取對數生長期細胞接種于6孔板，每孔約1×106個，培養箱培養12 h，棄去原培養基，血清饑餓法培養24 h，加入相應含藥血清培養基培養48 h。PBS洗滌，胰酶消化細胞，1 200 r/min離心4.5 min，細胞用PBS重懸，調整細胞密度為1.5×106個/mL，取1 mL細胞懸液，1 200 r/min離心4.5 min，吸去上清液，沉淀用PBS 300 μL重懸，加入無水乙醇，4 ℃固定過夜，離心，棄固定液，用RNase A液100 μL重懸細胞，37 ℃水浴30 min，加PI溶液400 μL充分混勻，4 ℃避光放置30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

2.6 qRT-PCR檢測

將BT549細胞接種于6孔板，每孔約5×105個細胞，培養箱培養12 h，棄去原培養基，血清饑餓法培養24 h，加入相應含藥血清培養基培養48 h。Trizol試劑盒提取細胞總RNA，取RNA 5 μg反轉錄為cDNA，行PCR。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測

細胞在25 cm2培養瓶培養12 h后，棄去原培養基，血清饑餓法繼續培養24 h，加入相應含藥血清培養基培養48 h，預冷PBS洗細胞1次，加入RIPA裂解工作液200 μL提取蛋白，冰上孵育5 min，收集細胞，4 ℃、12 000×g離心5 min，BCA法蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液，沸水滅活5 min，凝膠電泳（90 V、30 min，120 V、2 h），轉膜（200 mA、1.5 h），血清封閉2 h，加STAT1、STAT3、p53、Bax一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗（1∶10 000），孵育2 h，TBST洗滌，加發光劑避光反應3 min，顯影儀顯影，Image J軟件檢測條帶灰度值。

3 統計學方法

4 結果

4.1 陽和湯對BT549細胞形態的影響

空白對照組BT549細胞胞核邊緣清晰、著色均勻；陽和湯低、中、高劑量組和陽性藥組BT-549細胞均出現細胞邊緣不規則、細胞核深染、凋亡小體等典型的細胞凋亡現象，且陽和湯高劑量組凋亡更明顯。見圖1。

圖1 各組BT549細胞形態（DAPI染色，×500）

4.2 陽和湯對BT549細胞凋亡的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見表2。

表2 各組BT549細胞凋亡率比較（±s，%）

表2 各組BT549細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 6 6 6 6 6凋亡率4.85±0.53 21.48±1.52**7.88±0.67**12.65±0.61**17.52±0.90**

4.3 陽和湯對BT549細胞周期的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量組G0/G1期細胞比例增加，G2/M期細胞比例降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。見表3。

表3 各組BT549細胞周期分布比較（±s，%）

表3 各組BT549細胞周期分布比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 6 6 6 6 6 G0/G1期47.11±4.12 72.38±6.25**55.26±5.09*65.91±5.95**69.87±5.81**S期16.15±2.12 13.12±2.66 12.61±2.08 15.03±2.16 13.48±1.98 G2/M期36.74±3.58 14.50±1.75**32.13±3.15*19.06±2.65**16.65±2.43**

4.4 陽和湯對BT549細胞信號傳導和轉錄激活因子1、p53 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯高劑量組細胞STAT1 mRNA表達顯著升高（P<0.01），陽性藥組及陽和湯中、高劑量組細胞p53 mRNA表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）。見表4。

表4 各組BT549細胞STAT1、p53 mRNA表達比較（±s）

表4 各組BT549細胞STAT1、p53 mRNA表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 3 3 3 3 3 STAT1 1.00±0.00 2.72±0.34**1.48±0.09 1.54±0.38 2.19±0.32**p53 1.00±0.00 2.88±0.28**1.16±0.33 2.08±1.34*2.23±0.12**

4.5 陽和湯對BT549細胞信號傳導和轉錄激活因子1/3、p53、Bax蛋白表達的影響

與空白對照組比較，陽性藥組及陽和湯低、中、高劑量細胞p53、Bax蛋白表達顯著升高，STAT3蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）；陽性藥組及陽和湯中、高劑量組細胞STAT1蛋白表達顯著升高（P<0.01）。結果見圖2、表5。

圖2 各組BT549細胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白免疫印跡

表5 各組BT549細胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白表達比較（±s）

表5 各組BT549細胞STAT1、STAT3、p53、Bax蛋白表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組陽性藥組陽和湯低劑量組陽和湯中劑量組陽和湯高劑量組n 3 3 3 3 3 STAT1 0.57±0.02 1.22±0.03**0.64±0.09 0.75±0.03**0.88±0.03**STAT3 1.24±0.04 0.39±0.03**0.62±0.04**0.45±0.03**0.40±0.03**p53 0.48±0.02 1.13±0.07**0.68±0.08*0.68±0.09*1.09±0.06**Bax 0.29±0.02 1.02±0.13**0.52±0.07*0.77±0.09**0.84±0.07**

5 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌中最具侵襲性的亞型，其特點是雌激素受體、孕激素受體和原癌基因HER-2呈陰性表達。雖然三陰性乳腺癌占全部乳腺癌患者的15%～20%，但因其對HER-2選擇性和內分泌治療無效，缺乏特異性靶點，常規治療效果差。

隨著細胞和分子生物學的發展，乳腺癌的分子生物學機制研究已成為當前研究熱點[10]。細胞凋亡是機體程序性地清除部分多余、對機體有害細胞的自我防御機制，細胞的異常增殖和分化，以及細胞凋亡異常都可影響腫瘤發生發展[11-12]。STAT1是細胞內信號樞紐的一員，影響細胞的正?；顒庸δ埽谡{節癌細胞增殖與凋亡、調控細胞周期進程及癌癥相關免疫編輯等過程中發揮重要作用[13]。p53是重要的轉錄因子，可抑制腫瘤細胞生長。野生型p53（wtp53）能夠阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、增加腫瘤對放化療的敏感性，被視為重要的腫瘤抑制基因。STAT1能與p53形成絡合物，在p53依賴的細胞凋亡信號轉導通路中調節基因的轉錄活性，還可作為共活化劑增強p53介導的基因轉錄活性，從而加重DNA損傷和促進細胞凋亡[14]。STAT1通過調節p53的腫瘤抑制功能，從而對腫瘤放療敏感性產生影響。STAT3是關鍵的轉錄因子，可激活癌基因，促進腫瘤發生發展。在乳腺癌中，wtp53借助其下游因子Bax、Bcl-2等引起線粒體外膜通透性改變，形成凋亡復合體，誘導乳腺癌細胞凋亡[15]。

Bcl-2是一種癌基因，具有抑制凋亡作用[16]。Bax是最常見的促凋亡基因[15]，正常情況下，Bax位于胞質，在受到凋亡信號刺激后，Bax會移位到線粒體膜，并形成Bax/Bcl-2二聚體，促使線粒體膜形成孔道，導致細胞色素C釋放[17]，從而誘導細胞凋亡。激活的STAT1（白細胞介素、生長激素等激活）能促進Bax/Bcl-2二聚體解體，加速Bax蛋白釋放，誘導細胞凋亡[18]。本實驗通過觀察陽和湯含藥血清對BT549細胞STAT1、STAT3及下游p53、Bax等關鍵凋亡蛋白表達的影響，探討陽和湯治療乳腺癌的潛在機制。

結果顯示，低、中、高劑量陽和湯含藥血清干預BT549細胞后，G0/G1期細胞比例增加，G2/M期細胞比例降低，說明陽和湯可將BT549細胞的周期抑制在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。凋亡檢測中，隨著陽和湯含藥血清濃度增加，細胞凋亡率增加，表明陽和湯能誘導乳腺癌BT549細胞凋亡。通過Western blot和qRT-PCR實驗發現，與空白對照組比較，陽和湯各劑量組STAT1、p53、Bax表達升高，STAT3表達降低，表明陽和湯含藥血清可通過激活STAT1/p53信號通路及抑制STAT3，進一步上調下游促凋亡蛋白Bax表達，從而抑制癌細胞發展。

本實驗采用血清藥理學方法，以STAT1/p53信號通路為切入點，研究陽和湯治療三陰性乳腺癌的分子機制，可為其臨床應用和后續研究提供實驗支持。但三陰性乳腺癌發病機制復雜，涉及多因素、多靶點的共同作用，對其機制的進一步了解仍需后續深入研究。