靈仙新苷對膝骨關節炎軟骨細胞凋亡和自噬的影響

李納平 ，涂杜鑫 ，鄺高艷 ，劉鑫 ，譚旭儀 ，曾凡 ，盧敏

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410011； 2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是中老年人群常見的慢性退行性關節疾病，其病理特征主要包括關節軟骨退變、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化、大量骨贅生成等[1-2]。在OA好發部位中，膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）發病率最高，其次是手關節炎和髖關節炎，我國中老年人群KOA發病率為8.1%，且有不斷升高趨勢[3-4]。

關節軟骨退變被認為是KOA發病最關鍵的機制，軟骨細胞通過維持細胞外基質（ECM）合成與降解的動態平衡，從而在潤滑關節、維持關節軟骨機械形態方面發揮重要作用[5]，軟骨細胞凋亡會打破關節軟骨合成與降解的穩態平衡。自噬是細胞維持內穩態的關鍵機制，細胞通過自噬降解和再利用細胞中衰老的細胞器和大分子物質，從而避免直接死亡。研究發現，軟骨細胞自噬和KOA發生密切相關，通過激活自噬可以減少軟骨細胞凋亡，延緩關節軟骨退變[6-7]。中醫藥治療KOA具有多途徑、多靶點的特點，且不良反應少，能有效緩解KOA癥狀，延緩軟骨退變[8]。

中藥威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根莖，具有祛風濕、通經絡、止痹痛作用[9]，其三萜皂苷類成分在治療類風濕關節炎和KOA方面具有一定療效[10]，能通過抑制軟骨細胞凋亡[11]，維持ECM穩定[12]，從而延緩KOA關節軟骨退變。靈仙新苷（clematichinenoside AR，C-AR）是從威靈仙中提取的一種三萜皂苷，具有抗炎鎮痛作用，能將關節炎大鼠血清和尿液24種類風濕關節炎相關標志物調至正常水平，緩解關節炎癥狀[13]，并可通過激活自噬減輕氧化型低密度脂蛋白誘導的RAW264.7細胞炎癥[14]。但其能否治療KOA目前尚無報道。基于此，本研究觀察C-AR對KOA軟骨細胞凋亡和自噬的影響，為KOA治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

KOA關節軟骨樣本來自湖南中醫藥大學第一附屬醫院四肢關節科2021年1月－2021年12月接受全膝關節置換術的KOA患者。共14名患者，其中女性11名，男性3名，平均年齡（69.71±6.28）歲。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院倫理審查委員會批準（HNLL-2021-006-01），并獲得所有患者書面知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

靈仙新苷，貨號L-151，成都瑞思芬；DEME/F12、胎牛血清（FBS），貨號分別為11330032、10099，美國Gibco公司；活性氧（ROS）試劑盒、胰蛋白酶，貨號分別為S0033S、C0201，上海碧云天；Ⅱ型膠原酶，貨號9001-12-1，美國Sigma公司；白細胞介素（IL）-1β，貨號200-01B，美國Peprotech公司；IL-6、IL-8 ELISA檢測試劑盒，貨號分別為CSBE04638h、CSB-E04641h，武漢華美生物工程；BCA蛋白定量試劑盒，貨號10030908，長沙艾碧維；PBS、RIPA裂解液，貨號分別為G4202、G2002，武漢賽維爾；CCK8試劑盒，貨號NU679，日本同仁；Trizol總RNA提取試劑，貨號15596026，美國Thermo；HiFiScript cDNA Synthesis Kit，貨號CW2569，北京康為生物；甲苯胺藍染液，貨號BL539A，北京索萊寶；DAPI染色液，貨號C02-04002，北京Bioss；Ⅱ型膠原一抗，貨號AF0135，美國Affinity Biosciences；Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3B一抗，貨號分別為50599-2-Ig、19677-1-AP、11306-1-AP、18725-1-AP，美國Proteintech；Bcl-2一抗，貨號ab59348，英國Abcam；HRP-goat anti-mouse IgG、HRP-goat antirabbit IgG，貨號分別為SA00001-1、SA00001-2，美國Proteintech。SW-CJ-2FD超凈工作臺，江蘇蘇凈；HERAcell2401二氧化碳培養箱，美國Thermo；XDS-3倒置生物顯微鏡，上海奧顯；Enspire多功能酶標儀，美國Perkinelmer；LSM800激光掃描共聚焦顯微鏡，德國蔡司；Aria Ⅱ流式細胞儀，美國BD；MB-530酶標儀，深圳匯松。

1.3 細胞分離、培養及鑒定

參考文獻[15]采用二步酶消化法提取軟骨細胞，將軟骨組織剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱消化30 min，加入完全培養基（79% DMEM/F12+20% FBS+1%雙抗）終止消化。將軟骨組織轉移至離心管，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，加入與軟骨組織等體積的0.2% Ⅱ型膠原酶，轉移至無菌玻璃瓶，置于培養箱消化20 h。用70 μm細胞過濾器過濾，濾液1 200 r/min離心5 min，去除上清液，沉淀即為軟骨細胞。用完全培養基重懸細胞，接種至培養瓶，3～5 d換液1次，待細胞鋪滿瓶底80%以上后進行傳代。取P1代細胞進行甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定。

1.4 分組、造模及給藥

將軟骨細胞按1×105個/孔接種至6孔板，加入完全培養基，置于培養箱培養過夜。將細胞分為對照組、模型組和C-AR組，每組4個復孔，對照組正常培養，模型組參考課題組前期方法[16]加入10 ng/mL IL-1β處理24 h，C-AR組參照文獻[17]方法，先加入30 μmol/L C-AR預處理1 h，然后加入10 ng/mL IL-1β處理24 h。

1.5 CCK8法檢測細胞活力

將軟骨細胞以1×104個/孔接種至96孔板，使用完全培養基置于培養箱中培養24 h，然后換成無血清培養基繼續培養12 h，按“1.4”項下方法分組并進行干預，吸去培養基，每孔加入100 μL CCK8工作液（用PBS按1∶9稀釋），放入培養箱避光孵育2 h，酶標儀波長450 nm處檢測各孔吸光度（OD值）。

1.6 ELISA檢測

將細胞按“1.4”項下方法處理后，吸去培養基，加入預冷PBS洗滌細胞，將細胞轉移至離心管中，加入PBS，超聲破碎細胞，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，取上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測細胞IL-6和IL-8含量。

1.7 流式細胞儀檢測活性氧含量

按“1.4”項下方法處理細胞后，PBS洗滌細胞2次，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，無血清培養基洗滌細胞3次，收集細胞，使用流式細胞儀檢測ROS含量。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

按“1.4”項下方法處理細胞后，胰蛋白酶消化細胞，將細胞轉移至離心管，2 000 r/min離心5 min，沉淀用PBS洗滌2次，每次洗滌后2 000 r/min離心5 min，向樣品中加入結合緩沖液490 μL、Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL，室溫避光反應10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9 Western blot檢測

將細胞按“1.4”項下方法處理后，吸去培養基，加入RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。蛋白進行瓊脂糖凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Bax一抗（1∶5 000）、Caspase-3一抗（1∶1 000）、Bcl-2一抗（1∶500）、Beclin1一抗（1∶1 000）、LC3B一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。加相應二抗，室溫孵育90 min，ECL發光液顯影，凝膠成像系統成像。用Image-Pro Plus 6.0軟件對條帶進行灰度分析，以β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

1.10 qRT-PCR檢測

將細胞按“1.4”項下方法處理后，吸去培養基，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，根據HiFiScript cDNA Synthesis Kit，以總RNA為模板反轉錄合成cDNA，SYBR法對樣品進行qRT-PCR。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.11 免疫熒光檢測

將爬片放入6孔板中，以1×105個/孔接種細胞，按“1.4”項下方法處理。4%多聚甲醛固定30 min，加入0.3%Triton X-100，37 ℃通透15 min，5% BSA 37 ℃封閉10 min，加入LC3B一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜。滴加山羊抗兔IgG（1∶100），室溫避光孵育20 min，DAPI工作溶液染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件計算熒光強度。

1.12 統計學方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計分析。實驗數據以±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞鑒定

初期軟骨細胞呈不規則多角形或短梭形，隨著培養時間延長，形態多呈長梭形，細胞核呈圓形或橢圓形，細胞間有偽足相連，形態似成纖維細胞。甲苯胺藍染色可見胞漿呈淺藍色，細胞核為深藍色。Ⅱ型膠原免疫熒光染色顯示，胞漿及胞膜呈綠色熒光，表明培養的細胞表達特征性Ⅱ型膠原，細胞核被DAPI復染，呈藍色。見圖1。

圖1 人KOA軟骨細胞形態觀察及鑒定（×200）

2.2 靈仙新苷對軟骨細胞活力的影響

與對照組比較，模型組細胞活力顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞活力顯著升高（P<0.05）。結果見表2。

表2 各組軟骨細胞細胞活力比較（±s）

表2 各組軟骨細胞細胞活力比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組C-AR組n 4 4 4細胞活力1.60±0.07 0.97±0.04**1.31±0.04#

2.3 靈仙新苷對軟骨細胞白細胞介素-6和白細胞介素-8表達的影響

與對照組比較，模型組細胞IL-6和IL-8含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞IL-6和IL-8含量顯著減少（P<0.05）。結果見表3。

表3 各組軟骨細胞IL-6和IL-8含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組軟骨細胞IL-6和IL-8含量比較（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組C-AR組n4 4 4 IL-6 23.87±4.62 44.01±3.68**33.25±6.10#IL-8 57.79±5.48 97.10±6.26**83.92±3.68#

2.4 靈仙新苷對軟骨細胞活性氧含量及凋亡率的影響

與對照組比較，模型組細胞ROS含量顯著增加，凋亡率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞ROS含量顯著減少，凋亡率顯著降低（P<0.01）。結果見圖2、圖3、表4。

圖2 各組軟骨細胞ROS檢測

圖3 各組軟骨細胞凋亡率檢測

表4 各組軟骨細胞ROS含量和凋亡率比較（±s）

表4 各組軟骨細胞ROS含量和凋亡率比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組C-AR組n4 4 4 ROS熒光強度1 292±241.7 6 197±154.3**3 410±135.7##凋亡率/%4.19±0.26 25.86±0.59**17.35±0.97##

2.5 靈仙新苷對軟骨細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞Bax和Caspase-3蛋白表達顯著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞Bax和Caspase-3蛋白表達顯著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表達顯著升高（P<0.01）。結果見圖4、表5。

表5 各組軟骨細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

表5 各組軟骨細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組C-AR組n 4 4 4 Bax/β-actin 0.24±0.03 0.57±0.03**0.32±0.03##Bcl-2/β-actin 0.55±0.03 0.15±0.03**0.30±0.03##Caspase-3/β-actin 0.19±0.02 0.54±0.06**0.32±0.05##

圖4 各組軟骨細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白免疫印跡

2.6 靈仙新苷對軟骨細胞凋亡相關mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組細胞Bax和Caspase-3 mRNA表達顯著升高（P<0.01），Bcl-2 mRNA表達顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞Bax和Caspase3 mRNA表達顯著降低（P<0.01），Bcl-2 mRNA表達顯著升高（P<0.01）。結果見表6。

表6 各組軟骨細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

表6 各組軟骨細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組C-AR組n 4 4 4 Bax 1.00±0.06 5.33±0.29**2.84±0.35##Bcl-2 1.00±0.06 0.26±0.01**0.55±0.06##Caspase-3 1.00±0.07 3.49±0.21**2.12±0.21##

2.7 靈仙新苷對軟骨細胞自噬相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組細胞Beclin1蛋白表達和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞Beclin1蛋白表達和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值顯著升高（P<0.01）。免疫熒光結果顯示，與對照組比較，模型組細胞LC3B表達顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，C-AR組細胞LC3B蛋白表達顯著升高（P<0.01）。結果見圖5、圖6、表7。

圖5 各組軟骨細胞Beclin1、LC3B蛋白免疫印跡

圖6 各組軟骨細胞LC3B陽性表達（免疫熒光染色，標尺＝25 μm）

表7 各組軟骨細胞Beclin1、LC3B蛋白表達比較（±s）

表7 各組軟骨細胞Beclin1、LC3B蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01，與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組C-AR組Beclin1/β-actin 0.43±0.04 0.24±0.03**0.38±0.02##LC3BⅡ/LC3BⅠ2.22±0.06 0.42±0.03**0.93±0.04##LC3B熒光強度67 452±2 138 44 023±2 371**57 225±1 563##

3 討論

威靈仙是治療風濕痹痛的要藥。現代研究發現，威靈仙提取物及有效成分在治療KOA方面均能發揮積極作用[18]。馬勇等[19]運用威靈仙提取物對體外培養的兔膝關節軟骨細胞進行干預，發現其能促進軟骨細胞增殖及轉化生長因子β1 mRNA的表達，對關節軟骨產生保護作用，從而延緩KOA發展。此外，威靈仙提取物還能促進軟骨細胞ECM合成，維持軟骨細胞表型穩定[20]。本課題組前期研究發現，在獨活寄生湯基礎上加入威靈仙、黃芩等藥物能降低KOA兔血清及關節液炎癥因子表達，緩解軟骨退變[21]。體外實驗能通過調控Wnt/β-catenin信號通路抑制膝關節軟骨細胞凋亡[22]。

C-AR作為威靈仙中一種三萜皂苷類成分，在抗炎、抗氧化應激方面具有一定作用。炎癥反應貫穿KOA發病過程，促炎因子如IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α等在KOA發病過程中大量釋放，導致產生疼痛。軟骨細胞異常的氧化應激狀態也會誘發炎癥因子產生[10]，從而進一步加速軟骨細胞凋亡。研究發現，C-AR能降低TNF-α刺激下MH7A細胞IL-6和IL-8分泌，減少基質金屬蛋白酶產生，有效拮抗TNF-α誘導的炎癥和細胞毒性[17]。本研究發現，IL-1β刺激導致軟骨細胞活力降低，細胞IL-6和IL-8含量明顯增加，氧化應激水平也隨之升高，細胞凋亡率明顯升高。C-AR處理后，軟骨細胞活力升高，細胞IL-6和IL-8含量明顯減少，氧化應激水平和細胞凋亡率明顯降低，促凋亡Bax、Caspase-3基因和蛋白表達下調，抗凋亡Bcl-2基因和蛋白表達上調。提示C-AR可減輕體外培養的KOA軟骨細胞炎癥和氧化應激反應，抑制細胞凋亡。

自噬可恢復受損軟骨細胞功能，減少軟骨細胞凋亡，延緩KOA發生發展[23]。課題組前期研究發現，牛膝多糖能促進軟骨細胞自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達，抑制凋亡相關蛋白Fadd、Caspase-3/9表達，降低軟骨細胞凋亡率[24-25]，提示可通過促進軟骨細胞自噬抑制軟骨細胞凋亡。本研究結果顯示，C-AR組軟骨細胞自噬相關蛋白Beclin1、LC3B表達及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高，表明C-AR能促進自噬發生。結合細胞凋亡率可見，軟骨細胞凋亡與自噬水平呈負相關，隨著自噬增強，凋亡進一步減弱。

綜上所述，C-AR可減輕體外培養的KOA軟骨細胞炎癥和氧化應激反應，抑制軟骨細胞凋亡，其機制可能與激活自噬有關。本研究初步觀察了C-AR對KOA軟骨細胞自噬和凋亡的影響，對其通過哪些途徑激活自噬、抑制細胞凋亡及量效關系尚未明確，今后我們將繼續深入研究，為防治KOA提供更多依據。