基于UPLC指紋圖譜和化學計量學評價不同產地青蒿藥材質量

呂渭升 ，李振雨 ，侯栩軒 ，楊小龍 ，盧曉瑩 ，孫冬梅， ，陳向東 ，鄧淙友

1.廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244；2.江西一方天江藥業有限公司，江西 南昌 330006

青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，始載于《五十二病方》[1]，具有清透虛熱、涼血除蒸、解暑、截瘧功效[2]。青蒿主要化學成分包括黃酮類、香豆素類、萜類、苯丙酸類及揮發油等，主要有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常等藥理作用[3-5]，臨床多用于治療瘧疾、登革熱、慢性氣管炎[6-7]。青蒿生于曠野、山坡、路邊、河岸等處，廣泛分布于我國南北各地，尤以河南、廣西、廣東、重慶等地區產量較為集中[8]。

指紋圖譜從整體上對中藥進行研究，能夠較全面反映中藥所含的復雜成分及相互關系，是符合中藥特點的質量控制模式之一。目前中藥指紋圖譜廣泛應用于中藥質量評價的各環節，包括產地加工、采收時間、炮制加工等。隨著現代分析技術的發展，所獲得的色譜指紋圖譜越來越復雜，其通常包涵大量多維的信息和數據，導致有效提取指紋圖譜更加困難。化學計量學將多種數據分析方法如主成分分析、聚類分析和回歸分析等相結合，對多維、龐大、分散的數據進行篩選和提取，發掘數據間的定性、定量關系，解讀數據中蘊藏的意義，為全面深入控制中藥質量提供了有力保障。目前，指紋圖譜與關鍵成分定量相結合的中藥質量評價方法已成功應用于多種中藥，包括厚樸[9]、天麻[10]、蒲公英[11]等，但有關青蒿的研究相對較少。本研究對15批不同產地的青蒿藥材建立其UPLC指紋圖譜，同時對3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和東莨菪內酯進行含量測定，在此基礎上結合聚類分析、主成分分析（PCA）等化學計量學方法評價不同產地青蒿藥材質量，為全面、客觀、準確評價青蒿藥材質量提供依據。

1 儀器與試藥

Waters H-Class超高效液相色譜儀（美國沃特世公司），Scientific Q-Exactive Obitriap MS四極桿-靜電軌道阱高分辨質譜儀（美國賽默飛公司），ME204E萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），XP26百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），JJ600百分之一天平（常熟市雙杰測試儀器廠），KQ500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），Milli-Q級超純水系統（德國默克股份有限公司）。

液相用甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸、甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）為色譜級，其余試劑為分析純。新綠原酸（批號wkq18030107，含量98%），四川省維克奇生物科技有限公司；隱綠原酸（批號905-99-7，含量98%）、1-咖啡酰奎寧酸（批號18033004，含量99.9%），成都普菲德生物科技有限公司；夏佛塔苷（批號51938-32-0，含量95.60%）、東莨菪內酯（批號110768-200504，含量100%）、綠原酸（批號110753-201817，含量96.8%）、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號111782-201706，含量97.3%），中國食品藥品檢定研究院；東莨菪堿（批號DST210115-056，含量98%，成都樂美天醫藥科技有限公司）；3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸甲酯（批號CFN90856，含量98%，Chem Face）。15批青蒿藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定，為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，符合2020年版《中華人民共和國藥典》青蒿藥材項下規定，藥材來源見表1。

表1 15批青蒿藥材樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），質譜分析時B為0.4%甲酸溶液；梯度洗脫（0～5 min，12%～15%A；5～10 min，15%～20%A；10～12 min，20%A；12～15 min，20%～25%A；15～35 min，25%～38%A；35～55 min，38%～65%A）；流速0.25 mL/min；檢測波長350 nm；柱溫25 ℃；進樣量2 μL。

2.2 對照品溶液制備

取綠原酸對照品、東莨菪內酯對照品適量，加30%甲醇制成每1 mL含綠原酸50 μg、東莨菪內酯35 μg的混合溶液。

2.3 供試品溶液制備

取青蒿藥材粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用30%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定指紋圖譜，以3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗

取同一批次的青蒿藥材（S10）粉末共6份，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，分別進樣測定，分別測定6份樣品指紋圖譜，以3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，測定指紋圖譜，以3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜建立及共有峰標定

取15批青蒿藥材樣品，按“2.3”項下方法制備15份供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄各樣品指紋圖譜，并導出指紋圖譜CDF格式文件，將15批青蒿藥材指紋圖譜導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）軟件，以樣品S1的指紋圖譜為參照圖譜，進行保留時間校正和全峰匹配，15批青蒿藥材指紋圖譜共標識出22個共有指紋峰，以平均數法生成青蒿藥材對照指紋圖。15批青蒿藥材指紋圖譜疊加圖見圖1，青蒿藥材對照指紋圖譜見圖2。

圖1 15批青蒿藥材UPLC指紋圖譜

圖2 青蒿藥材對照指紋圖譜

2.6 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）計算15批青蒿藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結果見表2。15批樣品中有12批相似度均在0.9以上，相似度最高的3批為重慶產區樣品；其余3批樣品相似度低于0.9，分別為S8（廣西玉林）、S9（廣西玉林）和S15（河南駐馬店）。

表2 15批青蒿藥材指紋圖譜相似度評價

2.7 共有峰指認

通過對照品液相色譜保留時間比對及質譜精確分子量、碎片離子對比分析，對22個共有峰進行指認。質譜條件：采用加熱電噴霧離子源（HESI），噴霧電壓3.24 kV，正、負離子模式，掃描范圍100～1 500 m/z，鞘氣流速35 Arb，輔助氣流速10 Arb，毛細管溫度350 ℃，輔助器加熱溫度350 ℃，一級掃描分辨率70 000 FWHM，二級掃描分辨率17 500 FWHM，二級碰撞能量40 eV；S-lens電壓50 V。青蒿藥材正、負離子模式下總離子流圖及320 nm色譜圖見圖3。

圖3 青蒿藥材色譜圖

采用Compound Discoverer 2.1質譜分析軟件對目標色譜峰的一級和二級質譜進行解析，確定目標成分的精確分子量、質量數偏差及加合物離子信息，通過與mzCloud標準數據庫下碰撞能量為40 eV的二級質譜數據庫進行比對，共指認出10個峰，分別為1-咖啡酰奎寧酸（峰1）、新綠原酸（峰2）、東莨菪堿（峰3）、綠原酸（峰4）、隱綠原酸（峰5）、3-O-阿魏酰奎尼酸（峰6）、東莨菪內酯（峰7）、夏佛塔苷（峰10）、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（峰12）、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸甲酯（峰15）10個成分，化合物信息見表3。

表3 青蒿藥材化合物質譜指認

2.8 含量測定方法學考察

2.8.1 線性關系考察

精密稱取3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品17.513 mg，置20 mL量瓶中，加30%甲醇制成每1 mL含852.01 μg的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液5、2、1、0.5、0.2、0.1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加30%甲醇至刻度，制成每1 mL含3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸426.00、170.40、85.20、42.60、17.040、8.52 μg的對照品溶液。精密稱取東莨菪內酯對照品2.019 mg，置25 mL量瓶中，加30%甲醇制成每1 mL含80.76 μg的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液，按倍比稀釋法，依次制成每1 mL含東莨菪內酯40.38、20.19、10.10、5.05、2.53、1.27 μg的對照品溶液。分別取上述不同濃度對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的回歸方程為：Y=18 823.57X+8 248.59，R2=0.999 9，表明在8.52～852.01 μg/mL范圍內，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸濃度與峰面積線性關系良好。東莨菪內酯的回歸方程為：Y=38 439.11X+16 476.81，R2=0.999 9，表明在2.53～80.76 μg/mL范圍內，東莨菪內酯濃度與峰面積線性關系良好。

2.8.2 精密度試驗

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和東莨菪內酯的峰面積RSD分別為0.47%和1.25%，均小于3.0%，表明該方法精密度良好。

2.8.3 穩定性試驗

取青蒿藥材（S10）供試品溶液，分別在2、4、8、10、12、24 h進樣測定，計算3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和東莨菪內酯的峰面積RSD分別為0.23%和1.41%，均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8.4 重復性試驗

取同一份青蒿藥材（S10）粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，平行6份，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，外標法分別計算3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和東莨菪內酯的含量為3.425 mg/g和0.620 ng/g，RSD分別為1.36%和2.10%，均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.8.5 加樣回收率試驗

取青蒿藥材（S10）粉末約0.25 g，精密稱定，平行3組，每組3份，按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對照品，按“2.3”項下方法制備9份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率，結果顯示，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸回收率為95.52%，東莨菪內酯回收率為96.15%。根據2020年版《中華人民共和國藥典》“藥品質量標準分析方法學驗證指導原則”規定，樣品中待測成分含量在0.1%～1%范圍時，回收率限度為92%～105%。表明2種成分回收率良好。

2.9 化學計量學分析

2.9.1 主成分分析

PCA通過數據降維，樣品分布散點圖能夠直觀呈現樣品之間的距離。以22個共有指紋峰的峰面積為變量，采用PCA對15批青蒿藥材進行分析，通過SIMCA14.1軟件對歸一化后的數據進行多變量統計分析，建立PCA模型。結果顯示所有樣本均在95%置信區間內，模型解釋率參數R2X=0.958，預測能力參數Q2=0.561，表明提取的主成分可以解釋95.8%的原始變量，模型預測能力為56.1%。15批青蒿藥材樣品的PCA得分圖見圖4A，15批青蒿藥材主要分為兩類，重慶產地為一類，其他產地為一類。不同產地藥材差異較大，其中重慶3批藥材較為聚集，表明重慶產地藥材差異較小，河南產地6批藥材與廣東、廣西產地藥材較為聚集。PCA各特征峰變量載荷結果見圖4B，根據變量離原點的距離判斷變量對主成分的影響權重，距離原點越遠表示變量對主成分的影響權重越大。可以看出，分析變量對主成分1的影響權重大小依次為峰12、峰11，變量對主成分2的影響權重大小依次為峰9、峰8、峰15，這5個特征峰是PCA中有效體現不同產地青蒿樣品差異的強特征峰。

圖4 不同產地青蒿PCA得分圖和變量載荷圖

2.9.2 正交偏最小二乘判別分析

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）可以將原始數據的差異劃分為兩部分，一部分與Y變量相關，另一部分與Y不相關即正交垂直的差異。與PLS-DA相比，其能夠過濾掉更多的不相關信息，提高模型的預測能力及有效性。為進一步尋找不同產地的差異代謝物，以15批青蒿藥材的22個共有指紋峰的峰面積為變量，使用OPLS-DA模型驗證各組分離情況，R2Y和Q2分別代表模型可解釋的變量和可預測度，可對模型的優劣進行判別。模型R2X=0.996，R2Y=0.999，Q2=0.833。重慶產地和其他產地青蒿藥材OPLS-DA得分圖見圖5。可以看出，重慶產地與其他產地藥材顯著分離，表明二者差異較大。

圖5 不同產地青蒿藥材OPLS-DA模型得分圖

變量重要性投影（VIP）在OPLS-DA中用于評價變量對分類的貢獻程度，可根據VIP值確定潛在的生物標志物，有助于發現具有識別能力的重要變量。一般將VIP>1和P<0.05作為差異代謝物。不同產地青蒿藥材VIP見圖6。VIP>1的代謝物共有10個，分別是峰11（VIP=1.42）、峰16（VIP=1.45）、峰4（VIP=1.25）、峰12（VIP=1.25）、峰6（VIP=1.24）、峰20（VIP=1.23）、峰22（VIP=1.20）、峰7（VIP=1.12）、峰3（VIP=1.09）、峰5（VIP=1.07）。

圖6 不同產地青蒿藥材VIP

2.9.3 2種差異代謝物含量測定

OPLS-DA確定的10個差異代謝物中，峰3、4、5、6、7、12經質譜指認，可分為兩類：東莨菪內酯和東莨菪堿屬于香豆素類成分，綠原酸、隱綠原酸、3-O-阿魏酰奎尼酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸屬于苯丙酸類。為進一步明確不同產地青蒿藥材質量差異，選擇東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸進行含量測定。

取15批青蒿藥材粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，采用外標法計算各批樣品東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量，結果見表4。15批青蒿藥材樣品東莨菪內酯的含量為0.207～1.186 mg/g，均值為0.494 mg/g；3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量為1.028～5.875 mg/g，均值為3.19 mg/g。

表4 15批青蒿藥材東莨菪內酯和3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量測定結果（mg/g）

不同產地青蒿藥材東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量比較見圖7。可以看出，不同產地樣品2種成分含量差異較明顯，其中重慶產地樣品東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量均高于其他3個產地，河南產地樣品2種成分含量均較低。

圖7 不同產地青蒿藥材東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量比較

3 討論

本研究對供試品溶液制備方法進行了考察，包括提取溶劑、提取方式、提取時間及提取溶劑用量，最終確定樣品最佳前處理方法。提取溶劑分別考察了甲醇、70%甲醇、30%甲醇、10%甲醇、乙醇、水，結果顯示，不同提取溶劑對青蒿藥材特征峰影響較大，以70%甲醇和30%甲醇為提取溶劑時總峰面積/稱樣量較大，而30%甲醇的峰型及分離效果最佳，最終選擇30%甲醇為提取溶劑。試驗比較了超聲與回流2種提取方式，結果顯示，2種提取方式各特征峰的峰型及分離效果無明顯差別，但加熱回流時總峰面積/稱樣量高于超聲處理，因此選擇加熱回流作為青蒿藥材特征圖譜的提取方式。此外，對3種不同超聲時間以及3種料液比進行了考察，結果顯示，以總峰面積/稱樣量為指標，不同提取時間對青蒿藥材特征圖譜影響并不大，為保證提取完全，選擇加熱回流60 min。提取溶劑用量為50 mL以上時，總峰面積/稱樣量×溶劑用量無明顯變化，說明50 mL已提取完全，最終選擇50 mL為提取溶劑用量。

本研究基于指紋圖譜對4個產地15批青蒿藥材進行分析，共確定了22個共有峰，進一步基于UPLC-MS技術對其中峰形好、分離度大的部分指紋峰進行指認，共指認了10種化合物，主要包括1-咖啡酰奎寧酸、新綠原酸、東莨菪堿、綠原酸、隱綠原酸、3-O-阿魏酰奎尼酸等。相似度評價結果進一步分析可知，12批藥材的相似度>0.9，表明所建立的指紋圖譜有效可行，基于UPLC技術建立的青蒿指紋圖譜能夠相對全面地表征青蒿藥材中的化學成分，同時能有效區分和評價不同產地青蒿藥材。相似度評價結果顯示，不同產地的青蒿藥材質量存在一定差異，其中3批重慶產區樣品整體相似度較高。

為進一步探究不同產地青蒿藥材成分差異，采用PCA及OPLS-DA對15批青蒿藥材進行分析。PCA結果顯示，15批青蒿藥材差異較大，主要分為兩類，其中重慶產地為一類，其余產地為一類，表明重慶產地青蒿藥材與其他產地質量差異較大。

通過OPLS-DA確定了10種差異代謝物，為進一步探討不同產地青蒿藥材質量差異，在指紋圖譜基礎上增加對香豆素類和苯丙酸類成分含量測定。東莨菪內酯為香豆素類成分，具有抗菌消炎、祛痰止咳作用，對正常動物體溫及大腸桿菌內毒素致熱動物體溫有顯著的降低作用[12]，具有較強的水溶性和穩定性[13]，能夠反映青蒿發揮傳統功效“清熱解暑、除蒸”的藥理活性，被視為青蒿的有效成分之一。藥理研究表明，東莨菪內酯在抗炎、抗腫瘤、降壓等方面有很好的療效[14]。咖啡酰奎寧酸類化合物是植物體內重要的次生代謝產物，具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、調節血糖、血脂、血壓及保肝等多種生物活性[15]。對咖啡酰奎寧酸類成分進行藥理活性比較發現，綜合抗氧化活性，抗炎活性，抗菌、抗病毒作用，細胞保護作用，免疫調節作用，抗高血糖、高血脂作用，抗癌活性7個方面，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸明顯優于其他3個苯丙酸成分[16]，測定其含量代表苯丙酸類成分含量，具有一定的參考意義。3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為有機酸類成分，有報道咖啡酰奎尼酸衍生物具有抗炎、抗氧化、抗病毒等活性，可協同東莨菪內酯發揮抗風濕作用[17-18]。因此，選擇東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸進行含量測定。結果表明，重慶產地青蒿藥材2種差異代謝物的含量均高于其他3個產地，初步表明東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸可能作為區分重慶產地和其他產地的生物標志物。但從產地質量精準性評價角度而言，需要擴大種質資源，增加不同采收期的比較分析來進一步探索。

綜上所述，本研究建立的指紋圖譜能有效區分不同產地青蒿藥材，建立的東莨菪內酯和3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的含量測定方法豐富了青蒿中除青蒿素、山柰素外其他有效成分研究的內容。然而，本研究僅初步探究了不同產地青蒿藥材的差異性，今后將結合非靶向代謝組學和靶向代謝組學對青蒿整體代謝物進行研究，同時結合基因組學、蛋白組學等多組學平臺探究不同產地青蒿藥材質量差異的機制。