近紅外漫反射光譜法快速測定麥冬多指標成分含量

祁梅 ，顧志榮， ，李芹 ，王安紅 ，葛斌

1.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫藥研究中心，甘肅 蘭州 730000；3.西南醫科大學附屬醫院，四川 瀘州 646000

麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f.）Ker-Gawl.的干燥塊根，被《神農本草經》列為上品[1]，主要產于四川三臺和浙江杭州一帶，分別稱為“川麥冬”和“浙麥冬”，其中浙麥冬品質較川麥冬為優，但生產周期較川麥冬長，種植成本高，且近年生產規模有所萎縮[2]。二者屬于不同產地的同一種屬來源的中藥，其化學成分及藥理作用相同。研究表明，麥冬含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分[3]，具有抗動脈粥樣硬化[4]、抗心肌缺血[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、增強免疫[9]、鎮咳[10]、降血糖[11]等廣泛的作用。

2020年版《中華人民共和國藥典》麥冬項下僅以總皂苷含量進行質量控制，未將其他有效成分、有效部位或指標性成分作為質控指標[12]，因此難以對麥冬進行快速、全面的質量控制與評價。目前已實現麥冬中總皂苷、總黃酮、總多糖的近紅外光譜（NIR）快速測定[13-14]，對完善麥冬的質量控制體系作出了技術示范，但主要指標性成分及單體有效成分的快速測定對麥冬的質量控制更具有實際價值，而鮮見報道。本研究采集不同產區、不同采收期的麥冬樣品，建立其代表性成分麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B含量的NIR定量分析模型，實現其含量的快速測定，為麥冬的快速、全面質量控制與評價提供參考。

1 儀器與試藥

Nicolet-6700型傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo公司），Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Alltech 3300型蒸發光散射檢測器（ELSD，美國Grace公司），Milli-Q Advantage A10超純水儀（法國Merck Millipore公司），DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），AL204型萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），DD-5M型離心機（湘儀離心機儀器有限公司），SB25-12DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

120批麥冬樣品，采集（購買）于四川、浙江的3個主要產區，見表1。所有樣品均經甘肅中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為百合科沿階草屬植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f.）Ker-Gawl.的干燥塊根[12]。將樣品粉碎至過80目篩，冷藏備用。麥冬皂苷B對照品（批號CHB180122）、麥冬皂苷D對照品（批號CHB180120）、麥冬皂苷D′對照品（批號CHB180121）、甲基麥冬二氫高異黃酮A對照品（批號CHB190119）、甲基麥冬二氫高異黃酮B對照品（批號CHB190125），成都克洛瑪生物科技有限公司，質量分數均不低于98%；甲醇、乙腈均為色譜純，天津大茂化學試劑廠；其他試劑均為分析純。

表1 麥冬樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 近紅外光譜采集

儀器預熱30 min后，采用積分球漫反射方式采集NIR。取于60 ℃干燥至恒重的麥冬粉末適量，混勻，置于樣品旋轉杯內，壓實，以內置背景為參比，掃描范圍10 000～4 000 cm-1，掃描64次，分辨率8 cm-1，溫度（25±0.5）℃，相對濕度20%～30%，每批樣品重復采集3次，取平均光譜[15]。120批麥冬樣品NIR疊加圖見圖1。

圖1 120批麥冬樣品NIR疊加圖

2.2 化學參考值測定

2.2.1 供試品溶液制備

精密稱取麥冬粉末約4.0 g，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，超聲（頻率40 kHz，功率500 W）提取60 min，過濾，濾液60 ℃水浴蒸至近干，轉移至5 mL量瓶中，用甲醇洗滌并定容至刻度線，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液制備

分別精密稱取麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、麥冬皂苷B、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 7.72、8.62、5.51、10.14、7.53 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使完全溶解，并以甲醇定容至25 mL，制成濃度分別為0.308 8、0.344 8、0.220 4、0.405 6、0.301 2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件

檢測器為ELSD，采用Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0～60 min，35%A → 65%A），流速1 mL/min，柱溫35 ℃，漂移管溫度100 ℃，氮氣流速3.0 L/min，進樣量20 μL。色譜圖見圖2。

圖2 麥冬中5種成分HPLC圖

2.2.4 方法學考察及含量測定

經方法學考察，5種成分線性回歸方程相關系數為0.998 8～0.999 5；精密度試驗結果表明，5種成分峰面積RSD為0.71%～0.93%；穩定性試驗結果表明，5種成分的溶液在24 h內穩定；重復性試驗結果表明，5種成分峰面積RSD為1.45%～1.85%；5種成分平均加樣回收率為98.93%～102.33%，RSD為1.76%～2.21%。表明本試驗所采用的儀器及方法誤差均符合要求。按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定峰面積，采用外標標準曲線法計算樣品中5種成分含量的化學參考值。

2.3 定量校正模型建立

2.3.1 異常樣品剔除

異常樣品指光譜數據存在較大誤差的樣品，這些樣品會對所建模型的準確性及穩健性產生不利影響。本試驗利用Dixon檢驗剔除異常光譜[16]，結果共剔除8個光譜異常的樣品。

2.3.2 樣本集劃分

將經過Dixon檢驗的112批樣品按含量數值從小到大排列后，選取2/3作為校正集（75批），剩余1/3作為驗證集（37批），并且確保驗證集樣品含量在校正集樣品的含量范圍之內[17]。樣本集劃分與含量分布結果見表2。

表2 5種成分樣本集劃分與含量分布結果（mg/g，n=3）

2.3.3 光譜預處理方法選擇

NIR易受噪聲、基線漂移、樣品顆粒不均勻、光散射等多種因素干擾，引起隨機誤差，降低信噪比，使模型的準確性與穩健性降低，因此對光譜進行預處理非常重要。本試驗考察未處理光譜（None）、標準正態變量校正（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階導數（FD）、二階導數（SD）、11點移動窗口最小二乘多項式平滑（Savitzky-Golay smoothing，SG）和Norris導數濾波平滑等常見光譜預處理方法及組合方法。以決定系數（R2）、校正均方差（RMSEC）、預測均方差（RMSEP）和留一法交叉驗證均方差（RMSECV）為指標，篩選不同建模方法。R2越接近1，RMSEC、RMSEP和RMSECV越接近0，模型的穩健性及預測效果越好。結果表明，對麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B分別采用SNV+SD+SG、MSC+FD+SG、MSC+SD+SG、MSC+FD+Norris、MSC+FD+ SG進行光譜預處理所得模型預測效果最佳，見表3。

表3 5種成分最佳光譜預處理方法

2.3.4 光譜波段選擇

采用篩選出的最佳光譜預處理方法處理光譜后，用TQ Analyst 8.0軟件的自動優化功能，對不同光譜波段的建模效果進行考察，選取留一交叉驗證R2最接近1的波段為最佳建模波段。可得麥冬皂苷B的最佳建模波段為8 105.4～7 316.6 cm-1及9 713.4～8 945.5 cm-1，麥冬皂苷D的最佳建模波段為9 554.6～7 098.4 cm-1，麥冬皂苷D′的最佳建模波段為8 253.1～6 765.2 cm-1、9 425.4～9 005.8 cm-1及9 637.1～9 458.9 cm-1，甲基麥冬二氫高異黃酮A的最佳建模波段為9 252.6～4 125.1 cm-1，甲基麥冬二氫高異黃酮B的最佳建模波段為9 134.2～4 254.2 cm-1。

2.3.5 因子數選擇

采用內部交叉驗證法考察因子數對RMSECV及交叉驗證R2（%）的影響。當模型RMSECV較小且R2最接近1時，對應的因子數用于建模效果最佳。結果表明，麥冬皂苷B、麥冬皂苷D、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B的因子數分別選擇10、9、10、6、5時建模效果最佳。

2.3.6 定量模型建立與評價

通過上述模型優化過程，得到麥冬中5種成分的PLS模型建立方法，見表4。校正模型的相關性見圖3。其中，麥冬皂苷B定量校正模型R2=0.970 2，RMSEC=0.520 7，RMSEP=0.554 1，采用交叉驗證法判斷模型穩健性，交叉驗證R2=0.943 0，RMSECV=0.646 5；麥冬皂苷D定量校正模型R2=0.949 8，RMSEC=0.662 7，RMSEP=0.315 7，交叉驗證R2=0.920 6，RMSECV=0.358 3；麥冬皂苷D′定量校正模型R2=0.980 4，RMSEC=0.085 3，RMSEP=0.415 5，交叉驗證R2=0.951 6，RMSECV=0.693 3；甲基麥冬二氫高異黃酮A定量校正模型R2=0.959 3，RMSEC=0.812 2，RMSEP=0.567 4，交叉驗證R2=0.939 5，RMSECV=0.744 4；甲基麥冬二氫高異黃酮B定量校正模型R2=0.940 8，RMSEC=0.645 1，RMSEP=0.747 6，交叉驗證R2=0.928 3，RMSECV=0.884 9。由圖3可知，校正集與驗證集樣品均勻分布在回歸線兩側，表明模型預測值與實測值（化學參考值）之間具有較好的相關性，模型預測性能較為理想。

圖3 5種成分參考值與模型預測值的相關性

表4 5種成分PLS模型建立方法

2.3.7 外部驗證

選擇15批樣品掃描NIR，輸入模型進行外部驗證，檢驗模型的準確性，結果見表5～表9。可見，模型預測值的分布范圍與實測值基本相符，相對誤差均較小，預測結果較為準確。對各成分的模型預測值與實測值進行配對t檢驗，結果P值均大于0.05（α=0.05），預測值與實測值比較差異無統計學意義，表明2種檢測方法之間的系統誤差較小，可忽略不計。因此，利用NIR技術快速測定麥冬5種成分的含量是可行的。

表5 麥冬皂苷B的PLS模型外部驗證結果

表6 麥冬皂苷D的PLS模型外部驗證結果

表9 甲基麥冬二氫高異黃酮B的PLS模型外部驗證結果

表7 麥冬皂苷D′的PLS模型外部驗證結果

表8 甲基麥冬二氫高異黃酮A的PLS模型外部驗證結果

3 討論

本研究對象是百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f）Ker-Gawl.，不包含山麥冬[即百合科植物湖北麥冬Liriope spicata（Thunb.）Lour. var.proliferaY. T. Ma和Liriope muscari（Decne.）Baily]，2020年版《中華人民共和國藥典》將麥冬與山麥冬嚴格區分為2種不同的中藥。已有研究發現，山麥冬與麥冬的化學成分組成存在差異[18]。

傳統的麥冬采收期多根據經驗確定，如川麥冬在種植次年清明之后采收，而浙麥冬在種植后的第3年立夏后采收，兩者種植區域的東西跨度較大，采收期時間跨度也較大，因此其生產、加工、流通、使用等各環節的質量控制較難掌握。2020年版《中華人民共和國藥典》收載了麥冬水分、總灰分、水溶性浸出物和麥冬總皂苷的限量要求，規定含麥冬總皂苷以魯斯可皂苷元計不得少于0.12%[12]，但未對麥冬其他單體有效成分或有效部位進行要求。因此，目前尚缺少完善的含量標準評價麥冬質量及不同品種的差異。

川麥冬與浙麥冬化學成分種類及主要藥理作用未見明顯不同，但其成分含量存在明顯差異，主要表現為浙麥冬中麥冬皂苷B、麥冬皂苷D′、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、總黃酮及總多糖的含量更高，因此浙麥冬質量更優[19]。麥冬總皂苷、總黃酮是麥冬的主要有效部位，是其抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗腫瘤的物質基礎[4，20]。本研究建立的近紅外光譜模型可以準確測試2個產地麥冬中的3種主要皂苷及2種主要黃酮的含量，模型預測結果與實測結果無明顯差異，可為麥冬的質量控制提供快速、簡便的分析方法及評價依據。