廣西夾竹桃內生真菌的多樣性和抑制幾種水產病原菌活性篩選

宋靜靜, 羅美苗, 李 露, 楊子聰, 王琳, 諸葛才智, 邱清華, 朱開昕, 蘇本偉, 龔 斌*

( 1. 廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室， 北部灣大學 海洋學院， 廣西 欽州535011； 2. 北部灣大學 陶瓷與設計學院， 廣西 欽州535011； 3. 欽州市中醫醫院， 廣西 欽州535099 )

夾竹桃(Neriumoleande)是夾竹桃科(Apocynaceae)夾竹桃屬(Nerium)中的一種傳統藥用植物，含有非常豐富的活性化合物，在世界各地(特別是印度和中國)被廣泛應用。在傳統中醫中，被用于治療心臟疾病、糖尿病、哮喘、癌癥和癲癇等疾病( Elliott, 2002)。近代藥理活性研究表明，夾竹桃含有抗細菌(Hussain & Gorsi, 2004)、抗真菌(Hadizadeh et al., 2009)、抗病毒(Singh et al., 2013)、抗氧化(Dey et al., 2012)、抗瘧疾(Sharma et al., 2005)等多種活性成分。

內生真菌是植物微生態系統的重要組成部分，廣泛存在于植物的健康組織中。內生真菌及其次生代謝產物在藥理學和農業中應用廣泛(Alurappa et al., 2014)。從在紫杉的內生真菌Taxomycesandreanae中發現了抗癌化合物紫杉醇(Stierle et al., 1995)開始，目前已從植物內生真菌分離出多個抗病毒、抗腫瘤、抗微生物活性化合物，僅就抗微生物活性而言，就已發現了Altersolanol A、Enfumafungin、Colletotric acid、Jesterone、Hydroxy-jesterone、Guignardic acid、Pestacin、Isopestacin等幾十種活性化合物(Gupta et al., 2020)，并發現內生真菌可能在藥用植物活性物質的合成中有重要作用。國內外研究表明，目前有少量從夾竹桃中得到內生菌及其活性物質的報道(Vallabhbhai, 2008; Ramesha et al., 2013; Ren et al., 2016; Ma et al., 2017; 鄭浩等, 2020; 朱美林等, 2020)，但是，其對真菌的鑒定主要基于形態學特征。植物內生真菌很多不產孢，僅依靠形態學數據不能準確反應夾竹桃內生真菌種類，而采用分子系統的方法對夾竹桃內生真菌多樣性進行研究還未有報道。此外，目前研究發現的夾竹桃內生真菌及其活性物質的類型主要包括抗腫瘤、抗氧化、殺蟲、抗植物病原真菌、抗人體的病原菌等，而在抗水產病菌方面鮮有報道。

廣西地處亞熱帶地區，良好的環境孕育了很多藥用價值高的道地藥材，該區域藥用植物內生菌多樣性的研究可以為將來系統評估和確定藥材藥效的地域差異提供參考。目前，水產養殖中抗生素的使用受到了嚴格限制，導致新的水產病原菌及抗生素多耐藥菌不斷出現。夾竹桃內生真菌作為發掘天然活性化合物的重要資源，有希望從中獲得抑制水產病原菌的新型抗菌活性菌株和化合物。本研究擬對廣西欽州市夾竹桃中的內生真菌進行分離鑒定和抗菌活性篩選，以確定夾竹桃內生真菌多樣性究竟如何，有哪些內生真菌類型及其在不同組織的分布情況，以期能夠獲得一些具有抗水產病原弧菌活性的菌株，為進一步開發新型的抗菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預處理

夾竹桃樣品采集于廣西欽州市欽北區，經欽州市中醫院中藥研究所朱開昕高級工程師鑒定為夾竹桃屬夾竹桃(Neriumoleander)。選取健康夾竹桃的新鮮莖段和葉組織塊，用自來水沖洗表面的泥土和灰塵，在無菌操作臺中進行表面消毒：先將樣品浸泡在75%酒精中3～5 min，再轉入3%～5%的次氯酸鈉溶液中浸泡30 s，然后再用無菌水沖洗干凈。在超凈操作臺中放到干燥滅菌的培養皿中晾干，備用。

1.2 內生真菌分離和純化

將上述處理過的莖段和葉片組織用無菌剪刀剪成5 mm×5 mm小塊后，貼于PDA 培養基平板上；置于28 ℃恒溫培養箱倒置培養2～4 d，并定期觀察真菌的生長情況；得到生長狀況良好的菌株；待組織邊緣發現有菌絲長出時，在無菌環境下挑取菌絲尖端轉接到純化培養基平板上；經多次分離純化后再接種于 PDA 斜面作為保種，保存在4～8 ℃冰箱備用。

1.3 形態學鑒定

將分離菌株接種于PDA培養基平板中，放置于28 ℃培養箱中培養。在各菌株生長的最佳時期，對照《真菌鑒定手冊》(魏景超, 1979)，觀察菌落形態(菌落顏色、大小、性狀及邊緣等)、生長情況、菌絲體、孢子的形態特征和表面特征，拍照記錄。

1.4 DNA提取

菌絲體用液氮研磨至勻漿狀，再加入600 μL的CTAB提取液，65 ℃水浴45 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液；加入苯酚∶氯仿∶異戊醇混合液(25∶24∶1)，混勻后4 ℃條件下，10 000 r·min-1離心5 min；取上清液，加入-20 ℃預冷的異戊醇靜置數分鐘；室溫12 000 r·min-1離心5 min，去上清液；取沉淀，用75%乙醇洗沉淀，加50 μL無菌水，-20 ℃保存備用。

1.5 ITS rDNA 序列分析

提取內生真菌的DNA后，用真菌鑒定通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 擴增真菌ITS rDNA序列。PCR反應體系：ddH2O 20 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL (北京索萊寶生物科技有限公司)，10 μmol·L-1的引物各2 μL，10 ng·μL-1模板1 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，72 ℃延伸10 min。引物合成和測序都由北京六合華大基因科技有限公司完成。將獲得的序列用BLAST程序在GenBank數據庫中進行同源性檢索，比對得出與其相似性最高的核酸序列。通過MEGA7.0軟件使用鄰接法構建系統發育樹。

1.6 內生真菌次生代謝產物的提取和抑菌活性的測定

接種分離真菌于100 mL液體PDA培養基，于26～28 ℃在200 r·min-1轉速下培養10～20 d至菌絲體長滿三角瓶；8 000 r·min-1離心收集菌絲體，20 ℃下吹干水分；稱取0.3 g干燥后的菌體加入5 mL提取液(乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸=80∶15∶5)浸泡，然后將提取液靜置揮發，加入500 μL乙酸乙酯溶解提取物。抑菌活性指示菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus) 、魔鬼弧菌(Vibriodiabolicus)由本實驗室購買保藏；溶藻弧菌(V.alginolyticus)、坎氏弧菌(V.campbellii)分離自患病的魚蝦。分別接種到LB液體培養基中，30～35 ℃搖床上以200 r·min-1的轉速培養過夜。將上述菌液200 μL采用混菌法接種于培養皿中，采用濾紙片法測定抑菌活性，觀察抑菌圈的有無及大小，測量并記錄抑菌圈直徑(Gong et al., 2018)。該實驗使用濾紙片蘸取乙酸乙酯作為空白對照，陽性對照為濾紙片蘸取50 μg·mL-1的卡那霉素和氯霉素。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的形態學鑒定

如圖1所示，根據菌株的菌落、菌絲體和孢子的形態特征，對照《真菌簽定手冊》進行初步鑒定，分屬于7個屬。其中，葉部組織獲得12株菌，占63.16%，分屬于炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)、球座菌屬(Guignardiaspp.)、葉點霉屬(Phyllostictaspp.)、 新殼梭孢屬 (Neofusicoccumsp.) 和曲霉屬(Aspergillusspp.)；莖部分離到7株菌，分別屬于炭疽菌屬、隔孢殼科新屬(Nothophomasp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)，占分離總量的36.84%(表1)，表明夾竹桃的內生真菌在莖段、葉片組織中分布廣泛。

A. 菌株ye-130; B. 菌株ye-134; C. 菌株ye-135; D. 菌株ye-136; E. 菌株jing-116; F. 菌株jing-117; G. 菌株jing-119; H. 菌株jing-180。A. Strain ye-130; B. Strain ye-134; C. Strain ye-135; D. Strain ye-136; E. Strain jing-116; F. Strain jing-117; G. Strain jing-119; H. Strain jing-180.圖 1 夾竹桃部分內生真菌的典型菌落形態Fig. 1 Colony morphology of some endophytic fungi isolated from Nerium oleander

表 1 夾竹桃不同組織中內生真菌屬的組成Table 1 Composition of endophytic fungi in different tissues of Nerium oleander

2.2 夾竹桃內生真菌的分子生物學鑒定

通過對得到的19株內生真菌的DNA 進行PCR擴增和ITS測序，并進行BLAST分析，結果表明這19株內生真菌都屬于子囊菌門，涵蓋5個目7個屬，且ITS序列和GenBank相似性都在98%以上(表2)。基于ITS 序列用MEGA 7軟件構建的系統進化樹(圖2)顯示有6個分支，其中ye-127、ye-129、ye-130、ye-131、ye-132、ye-133和ye-134都屬于葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)，與Guignardiaalliacea、G.musicola、Phyllostictafallopiae構成一個分支；jing-114、jing-115、jing-116、jing-118、jing-179、ye-126、ye-128都屬于小叢殼目(Glomerellales)，與Colletotrichumfructicola和C.citri-maximae構成一個分支；jing-117與Neofusicoccumparvum構成一個分支；jing-180屬于間座殼目(Diaporthales)，和Diaporthesp.構成一個分支，其親緣關系比較近。ye-135、ye136和jing-119共同構成一個大的分支，其中jing-119與Nothophomaanigozanthi親緣關系較近。ye-135、ye136都屬于Aspergillus，其中ye-135與Aspergillusneoellipticus親緣關系較近，而ye136與A.tamarii親緣關系較近。

表 2 夾竹桃內生菌ITS序列BLAST分析Table 2 BLAST analysis of ITS sequence of Nerium oleander

圖 2 NJ法構建的夾竹桃內生真菌ITS序列系統進化樹圖Fig. 2 Phylogenetic tree of ITS rDNA sequences of endophytic fungi of Nerium oleander by NJ method

2.3 內生真菌在夾竹桃組織中的分布

分離獲得的內生真菌菌株中，優勢屬為球座菌屬和炭疽菌屬，其中炭疽菌屬為7株，分離率為36.85%，主要分布于莖段中；球座菌屬分離到4株菌，分離率為21.05%，全部來源于葉組織；葉點霉屬分離到3株菌，分離率為15.79%，曲霉屬分離到2株菌，分離率為10.53%，全部來源于葉組織。另從葉片中分離到1株新殼梭孢屬真菌，從莖段中分離到隔孢殼科新屬、間座菌屬真菌各1株(表3)。

表 3 夾竹桃內生真菌在組織中的分布情況Table 3 Distribution of the endophytic fungi in Nerium oleander

2.4 內生真菌抑菌活性的分析

挑選分離到的代表菌株進行液體發酵培養。將菌絲體和發酵液在干燥箱中干燥后用浸提液進行浸提。采用浸提物對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、坎氏弧菌和魔鬼弧菌進行抑菌活性檢測。結果(表4)顯示，jing-116、ye-135、ye-136對芽孢桿菌有較強的抑制效果，其中jing-116、ye-135的抑菌圈分別為7.98 mm和9.29 mm，ye-136更是高達15.36 mm；ye-134對溶藻弧菌有抑制效果，抑菌圈為6.65 mm；jing-117、ye-130、ye-136對坎氏弧菌有抑制效果，抑菌圈分別為8.28、8.33、9.74 mm。抑菌實驗結果表明，具有抑菌活性的內生真菌在夾竹桃的不同組織中均有分布，其中葉片中內生真菌的抑菌活性略高于莖段。

表 4 分離出的內生真菌的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of the isolated endophytic fungi

3 討論與結論

本研究從夾竹桃的葉和莖中分離到19株內生真菌，采用形態學結合ITS序列分析表明其分屬于7個屬，優勢屬包括炭疽菌屬、球座菌屬、葉點霉屬，其他還包括新殼梭孢屬、曲霉屬、隔孢殼科新屬、間座殼屬。其他學者對夾竹桃內生真菌的研究中也曾分離到炭疽菌屬(Ramesha et al., 2013)，而其他6個屬在以往的夾竹桃內生真菌的研究中較少被提及，這可能是因為球座菌屬、葉點霉屬、新殼梭孢屬、曲霉屬、隔孢殼科和間座殼屬較少產孢，依靠形態學的鑒定方法較難準確鑒定這些真菌。例如，從夾竹桃中分離到42株內生真菌，分屬于14個類群， 依靠形態能夠確認的僅包括炭疽菌屬、毛殼菌屬和枝孢霉屬(Huang et al., 2007)；而印度學者Ramesha等(2013)從夾竹桃中分離到28株內生真菌，也僅描述出鐮刀菌(FusiumsemitectumNOF-3)、交鏈孢菌(AlternariaNOF-7)、球孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesNOF-8)和菌絲霉菌(MyceliasteriliaNOS-6) 這些比較容易通過形態學進行鑒定的種屬。本研究利用形態學結合ITS序列分析相互結合的方法，準確地鑒定出夾竹桃內生真菌的類型及其在不同組織的分布狀況等，首次為夾竹桃內生真菌多樣性的研究提供了準確的參考數據。

本研究分離得到6株活性菌株(jing-116、jing-117、ye-130、ye-134、ye-135、ye-136)，其中大部分抗菌活性較強的內生真菌(如ye-130、ye-134、ye-135和ye-136)來源于夾竹桃的葉，而夾竹桃的強心甙、三萜皂甙等活性成分也主要分布在葉中，表明內生真菌的活性可能與宿主植物有關(Radu & Kqueen, 2002)。因此，從植物的藥用部位分離內生真菌獲得活性菌株的機會可能更大(Gouda et al., 2016)。另外，本研究分離到的球座菌屬和炭疽菌屬包含多株真菌，如ye-127、ye-129、ye-130、ye-132的ITS序列相同，均屬于球座菌屬(Guignardia)，僅ye-130有抗菌活性；同理jing-115和jing-116的ITS序列相同，均屬于炭疽菌屬(Colletotrichum)，僅jing-116有抗菌活性，說明抗菌活性具有菌株特異性，與Phongpaichit等(2006)的研究結果一致。這說明在做夾竹桃內生真菌分離時，通過增加分離的真菌數量，將有利于得到更多抗菌活性菌株。

本研究分離得到的抗細菌活性的內生真菌中，ye-134(球座菌屬，Guignardiasp.)對溶藻弧菌有抑制作用，jing-117(新殼梭孢屬，Neofusicoccumsp.)、ye-130(Guignardiasp.)和ye-136(曲霉屬，Aspergillussp.)對坎氏弧菌有抑制作用。坎氏弧菌(Dong et al., 2017)是最近幾年發現的病原弧菌，因此本研究展現了其良好的應用前景。目前，從曲霉屬真菌中有發現鰻弧菌(Guo et al., 2016)、副溶血性弧菌(Zhu et al., 2018)、抗哈維氏弧菌(Guo et al., 2019)的活性物質，但還未從新殼梭孢屬和球座菌屬真菌中發現抗弧菌的真菌和活性物質。新殼梭孢菌是植物病原菌，目前包含大約50個種，從7個種的新殼梭孢菌中分離鑒定了9類化合物，包括環己烯酮、5，6-二氫-2-吡喃酮、麥托考酮、萘酮、萘醌、酚和醇、倍半萜等(Salvatore et al., 2021)。球座菌屬真菌也曾經在其他植物內生真菌中發現有抗菌活性(Gong et al., 2014)。在后續研究中，我們將針對ye-134、ye-130和jing-117開展活性物質的研究，有望獲得一些新型的抗水產病菌的抗菌劑。