石榴皮止瀉散體外抑菌效果研究

伊鵬霏，繆雨臻，蘭新財，夏 方，安麗娜，趙麗麗*

(1.吉林大學 動物醫學學院，長春 130062；2.浙江金大康動物保健品有限公司，浙江金華 321016；3.石家莊藏諾藥業股份有限公司，石家莊 050021)

石榴皮止瀉散是由石榴皮飲片和滑石經加工制成的散劑，具有澀腸止瀉之功效，主治仔豬白痢。仔豬白痢(White Scour of Piglets)是由致病性大腸桿菌引起的10～30日齡仔豬非敗血性、急性腸道傳染病。臨床表現為拉乳白色或灰白色稀糞，且糞便漿糊狀，腥臭黏膩。病豬嚴重脫水，可視黏膜蒼白[1]。該病流行廣，傳播快，發病率可達80%，且有明顯上升的趨勢。如不及時治療或治療不當，輕者影響仔豬生長發育，重者造成僵豬，給養豬業造成巨大經濟損失。

石榴皮的清熱、解毒、健胃、潤肺、澀腸、止血等功效，得到歷代醫學家的肯定，中國藥典與中國獸藥典歷版均有收載。石榴皮主含鞣酸類，有收斂殺菌效果，能夠澀腸止血，加之其具有良好的抑菌作用，可治療痢疾、腹瀉、便血等病癥，將石榴皮用水煎煮或粉碎后直接拌料，治療效果明顯。其配伍具有吸附細菌與毒素作用的滑石，組成復方制劑，可增強療效，發揮更強的治療效果。在《中國獸藥典(2015年版)》二部中就收載了多個配伍滑石的止瀉止痢復方制劑，如止痢散、雞痢靈片、雞痢靈散等，均配伍了10%～50%不等的滑石藥材。

本研究旨在觀察石榴皮止瀉散對豬大腸桿菌的抑制作用，并測定其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，為臨床進一步研究其對仔豬白痢的治療效果提供基礎。

1 材 料

1.1 菌株 大腸桿菌ATCC25922，購自中國藥品生物制品鑒定所；豬源產腸毒素大腸桿菌CVCC 196，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗藥品 石榴皮止瀉散，由浙江金大康動物保健品有限公司生產，包裝規格為：800 g/袋；批號為：20170303；用法：口服。

1.3 試劑 MH肉湯培養基、普通肉湯培養基購自青島高科園海博生物技術有限公司，瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物購自英國迪爾拜生物公司，氯化鈉購自北京化工廠。

1.4 主要儀器 恒溫培養振蕩器，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；TGL-16B型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；精密電子天平，BSA224S，賽多利斯科學儀器(北京)有限責任公司；pH計，FiveEasy，梅特勒托利多。

2 方 法

2.1 石榴皮止瀉散水煎液的制備 將石榴皮止瀉散用紗布包裹置于鍋內，加入約8倍量純凈水，浸泡30 min后，武火加熱至沸，文火煎煮30 min，澄出藥液。再加入約6倍量純凈水，同法煎煮后澄出藥液，將兩次藥液合并后過濾，用旋轉蒸發器60 ℃濃縮至每1 mL藥液相當于1 g生藥的濃度，并用0.1 M/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌15 min，于4 ℃冰箱暫存，使用前水浴加熱至37 ℃。

2.2 平板法抑菌試驗

2.2.1 菌液制備及細菌濃度調整 將大腸桿菌ATCC25922和豬源產腸毒素大腸桿菌CVCC 196分別接種于LB液體培養基，37 ℃過夜培養。倒板法細菌計數：取適量菌液，稀釋107、108或109倍，取1 mL稀釋液分別加入培養皿中，然后向平皿倒入適量冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養基，混勻，凝固后轉入37 ℃培養箱，培養48 h，計數單菌落個數，每個濃度重復6個平板。調整細菌濃度為108cfu/mL。

2.2.2 抑菌試驗 無菌條件下，分別取100 μL 2種供試菌液，均勻涂布于MH肉湯固體培養基表面，待培養基表面晾干后，用滅菌的打孔器在培養基上打直徑為6 mm的圓孔，將石榴皮止瀉散水煎液滴滿孔，重復3孔，另設一孔生理鹽水對照孔，靜置15 min后平穩的轉入37 ℃培養16 h，取出平板觀察是否有抑菌圈，并用直尺測量抑菌圈直徑。

2.3 MIC和MBC的測定

2.3.1 大腸桿菌肉眼可見濃度的判定 藥物對細菌MIC的測定通常是通過肉眼觀察菌液是否變渾濁，來判斷細菌是否有明顯的增殖。因較高濃度的中藥有顏色干擾，不能單憑肉眼或借助分光光度計判斷是否有細菌增殖，因而先對肉眼可見細菌濃度進行測定。

將大腸桿菌ATCC25922接種于LB液體培養基，37 ℃培養12 h，細菌計數后，用新鮮MH肉湯培養基調整細菌濃度為4×107cfu/mL、2×107cfu/mL、107cfu/mL和5×106cfu/mL，肉眼觀察菌液是否渾濁。

2.3.2 菌液制備及細菌濃度調整 將大腸桿菌ATCC25922和豬源產腸毒素大腸桿菌CVCC 196分別接種于LB液體培養基，37 ℃過夜培養。倒板法細菌計數后，用新鮮MH肉湯培養基稀釋，調整細菌濃度為106cfu/mL。

2.3.3 測定MIC 將石榴皮止瀉散水煎液用MH培養基稀釋至400 mg/mL。其余參照文獻[1-3]進行，如表1：取9支滅菌試管，編號排列在試管架上，于每管中加入1 mL新鮮的MH培養基，然后向第1支試管中加入1 mL石榴皮止瀉散稀釋液，混勻后取1 mL加入到第2支試管，依次倍比稀釋至第9管，棄去1 mL。然后向各試管中加入1 mL細菌濃度為106cfu/mL的大腸桿菌ATCC25922菌液，混勻，各管的含藥濃度依次為100 mg/ml、50 mg /mL、25 mg /mL、12.5 mg /mL、6.25 mg /mL，細菌濃度為5×105cfu/mL。另設1支陽性對照(1 mL MH培養基加1 mL大腸桿菌ATCC25922菌液)和1支陰性對照(2 mL MH培養基)。37 ℃培養16 h。大腸桿菌CVCC 196的檢測方法同上。

表1 MIC測定方法Tab 1 MIC determination method

將培養好的菌液進行倒板法細菌計數[2-4]。倒板法細菌計數的方法如下：將各含藥菌液于37 ℃培養16 h后，分別取適量進行倍比稀釋，然后分別取1 mL稀釋倍數為103、104、105倍的稀釋液，加入培養皿中，然后向平皿倒入適量冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養基，混勻，凝固后轉入37 ℃培養箱，培養48 h，計數單菌落個數。

2.3.4 測定MBC 取高于MIC的所有試管中的液體適量，稀釋10倍后，取1 mL加入培養皿中，然后向平皿倒入適量冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養基，混勻，凝固后轉入37 ℃培養箱，培養48 h，計數單菌落個數。菌落數低于5個且含藥液最少的藥液濃度即為MBC[4]。

3 結果與分析

3.1 平板法抑菌試驗 石榴皮止瀉散水煎液孔周圍均有明顯的抑菌圈出現(圖1)，抑菌圈直徑詳見表2；生理鹽水對照孔周圍沒有抑菌圈。石榴皮止瀉散水煎液有明顯的抑制大腸桿菌的效果。

A：石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌ATCC25922的抑菌圈B：石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌CVCC 196的抑菌圈A:Bacteriostatic circle of pomegranate peel Decoction for Relieving diarrhea and dispersive water against Escherichia coli ATCC25922B:Bacteriostatic circle of pomegranate peel Decoction for Relieving diarrhea and dispersive water against Escherichia coli CVCC 196圖1 石榴皮止瀉散水煎液體外抑制大腸桿菌生長Fig 1 pomegranate peel antidiarrheal powder Decoction inhibits the growth of Escherichia coli in vitro

表2 石榴皮止瀉散水煎液體外抑制大腸桿菌生長試驗結果(n=3)Tab 2 Experimental results of pomegranate peel antidiarrheal powder Decoction inhibiting the growth of Escherichia coli in vitro (n=3)

3.2 大腸桿菌肉眼可見濃度的判定 細菌濃度為4×107cfu/mL、2×107cfu/mL和107cfu/mL的菌液呈渾濁狀，其中濃度為107cfu/mL的菌液渾濁程度較輕；細菌濃度為5×106cfu/mL的菌液不可見渾濁(表3、圖2)。即大腸桿菌肉眼可見濃度為大于或等于107cfu/mL。所以細菌濃度小于107cfu/mL即判為無大量細菌生長。

表3 肉眼可見細菌濃度判定Tab 3 Determination of visible bacterial concentration

1：陰性對照；2：細菌濃度為4×107cfu/mL的菌液；3：細菌濃度為2×107cfu/mL的菌液；4：細菌濃度為107cfu/mL的菌液；5：細菌濃度為5×106cfu/mL的菌液。1: Negative control;2: The concentration of bacteria was 4×107cfu/mL bacterial solution;3: The concentration of bacteria was 2×107cfu/mL bacterialsolution;4: The concentration of bacteria was 107cfu/mL bacterial solution;5: The concentration of bacteria was 5×106cfu/mL bacterial solution.圖2 肉眼可見細菌濃度判定Fig 2 Determination of bacteria concentration visible to the naked eye

3.3 石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌MIC的測定 藥物濃度為100 mg/mL、50 mg/mL的培養液(第1、2支試管)對應的細菌計數的各個平板上均沒有細菌生長，即該培養液的細菌濃度為0；藥物濃度為25 mg/mL的培養液(第3支試管)對應的部分平板可見單菌落生長，選擇其中較為適合計數的一組平板進行單菌落計數，可得該培養液的細菌濃度均低于107cfu/mL；藥物濃度為12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.562 mg/mL、0.781 mg/mL和0.390 mg/mL的培養液(第4、5、6、7、8、9支試管)對應的各個平板上均形成菌苔，不適合計數，可得該培養液的細菌濃度遠大于107cfu/mL。詳細數據及相對應的培養液的細菌濃度見表4、表5。

表4 各含藥培養液的細菌濃度Tab 4 bacterial concentration of each medicated culture medium

表5 含25 mg/mL石榴皮止瀉散培養液的細菌濃度Tab 5 bacterial concentration of culture solution containing 25 mg/mL pomegranate peel Zhixie powder

即藥物濃度為25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL時，培養液的細菌濃度低于107cfu/mL，無大量細菌生長。故石榴皮止瀉散水煎液對兩株大腸桿菌的最小抑菌濃度均為25 mg/mL。

3.4 石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌MBC的測定 高于MIC的所有培養液對應的平板上均無細菌生長，所以石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌的MBC為50 mg/mL。

4 討論與結論

石榴皮是一味具有悠久應用歷史的中獸藥，為石榴科植物石榴PunicagranatumL. 的干燥果皮，中國獸藥典記載[5]，味酸、澀，性溫，歸大腸經，具有澀腸止瀉、止血，驅蟲等功效。用于久瀉，久痢，便血，脫肛，帶下，蟲積腹痛。而仔豬白痢臨床表現為拉乳白色或灰白色稀糞，且糞便漿糊狀，腥臭黏膩。臨床選用石榴皮止瀉散進行治療，能有效緩解仔豬白痢的癥狀。而造成仔豬白痢的病原是大腸桿菌，眾多研究報告表明，中藥石榴皮對多種細菌、真菌有抑制或殺滅作用，石榴皮的水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、黑曲霉、綠膿桿菌、白色念珠菌等有顯著抑制作用，其抑菌的主要成分可能為多酚類物質和生物堿[6-9]。

陳雪珊等通過一系列的抑菌試驗來驗證石榴皮的抑菌效果，石榴皮提取液、濃縮液、冷干粉末及軟膏對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌圈直徑分別在23.5～11.6 mm，最小抑菌濃度在2500～78.1 μg/mL，最小殺菌濃度在5000～156.3 μg/mL[7]，表明石榴皮的提取液、濃縮液、冷干粉末及軟膏均具有較好的體外抗菌活性，幽門螺桿菌甲硝唑耐藥株及敏感株都對其敏感[10]，對鮑曼不動桿菌也有較好的抑制作用[11]。熊素英等用石榴皮醇提液進行試驗，證明其具有廣譜抗菌作用，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為3.125%，對枯草芽抱桿菌和蠟狀芽抱桿菌為6.25%，對大腸桿菌為12.5%，對青霉和黑曲霉分別為12.5%、25%，對啤酒酵母和面包酵母為50%[12]。董周永等研究認為，石榴果皮提取物的抑菌機理是其抑制了菌體的己糖磷酸途徑(HMP)引起代謝功能障礙，使調控菌體生長、分裂相關蛋白的合成受到抑制，引起細胞質固縮，最終使菌體的生長繁殖受到抑制，甚至死亡[13]。

滑石為硅酸鹽類礦物滑石族滑石，主含含水硅酸鎂[Mg3(Si4O10)(OH)2]。滑石粉具有保護皮膚和粘膜的作用，能吸附大量化學刺激性物或毒物，因此當撒布于發炎或破損組織的表面時，可有保護的作用；內服時除保護發炎的胃腸粘膜而發揮鎮吐、止瀉作用外，還能阻止毒物在胃腸中的吸收。滑石粉還有抗菌作用，用平板法使培養基含10%的滑石粉，對傷寒桿菌與副傷寒甲桿菌有抑制作用；用紙片法則僅對腦膜炎球菌有輕度抑菌作用。

本研究對由石榴皮和滑石制成的石榴皮止瀉散水煎液進行抑菌試驗結果也表明，含藥濃度為1 g/mL的石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌有明顯的抑制作用，對大腸桿菌的MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL。

每1 mL含1 g生藥的石榴皮止瀉散水煎液在體外對大腸桿菌(大腸桿菌ATCC25922，大腸桿菌CVCC 196)具有抑制作用，MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL。